前言：为响应健康中国2030要求，推动全国肿瘤病理诊断能力提升、质量控制，由北京健康促进会发起并主办的“星光生辉—肿瘤规范化病理示范活动”专题推文活动将于近期在91360智慧病理网旗下多个自媒体平台发行举办。活动以肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌四大恶性肿瘤为重点开展，以基层肿瘤诊疗规范化建设、肿瘤诊断标准规范流程等内容进行专家专访或解读为主，通过详细的学术分享以促进医院肿瘤诊疗规范化及病理医生肿瘤诊断能力提升。
在临床实践中，多数NSCLC患者初诊往往已到中晚期，难以手术；部分NSCLC患者肿瘤还伴有异质性，使得常规FFPE样本的基因检测结果与靶向治疗效果不符。此时采用肺癌患者血液ctDNA进行分子检测可有助于肺癌患者的靶向治疗。本文主要就血液中ctDNA标本的处理以及其在肺癌分子检测中的应用等相关内容进行介绍。
近年来，随着分子病理诊断技术及靶向药物研发不断进步，精准医学与个性化用药的理念在肿瘤治疗中已取得长足发展。其中，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的分子靶向治疗是肿瘤精准诊疗最为普及的临床实践。临床医生基于患者驱动基因的差异，如表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR，45%-55%）、KRAS（8%-10%）、间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK，5%-10%）等【1, 2】。针对上述突变给予不同靶向治疗药物，显著延长患者的生存时间，提高生活质量。
在常规诊疗过程中，经手术治疗的肺癌患者，手术切除样本送病理后，石蜡切片（FFPE）样本进一步开展分子检测，包括PCR、第二代测序（NGS）等，评估肿瘤突变类型是否适合靶向治疗已成为当前NSCLC诊疗共识【2】。但是在临床实践中，多数NSCLC患者初诊往往已到中晚期，难以手术，甚至部分患者穿刺活检也无法耐受，导致肿瘤组织样本难以获取开展正常途径的分子检测。此外，部分NSCLC患者肿瘤还伴随有异质性，使得常规FFPE样本的基因检测结果与靶向治疗效果不符【3】。基于上述种种原因，我国NSCLC患者分子检测率偏低。因此，探寻作为其补充或替代的其他生物标本进行EGFR基因检测具有重要临床意义，也有助于提高临床患者的总体EGFR基因受检率。
近年来，肿瘤患者液体活检技术飞速发展，包括外周血中循环游离DNA（cfDNA）及循环肿瘤DNA（ctDNA）检测应用于肿瘤分子检测已有大量报道。研究表明，大部分晚期NSCLC患者的血液中均能检出循环游离DNA（cfDNA）及循环肿瘤DNA（ctDNA）【3-5】；将外周血ctDNA样本应用于EGFR基因突变检测结果能够有效预示EGFR靶向抑制剂疗效【6，7】。因此，当肿瘤组织难以获取时，如晚期NSCLC患者无法行手术及穿刺时即可开展血液ctDNA检测，作为肿瘤组织检测的重要补充。且在部分情况下，如肿瘤术后复查、肿瘤复发或靶向治疗发生耐药时复检肿瘤分子特征具有不可代替性。2015年《NSCLC血液EGFR基因突变检测中国专家共识》在推荐所有NSCLC患者均应接受肿瘤组织EGFR突变检测的基础上，补充了如果肿瘤标本不可评估，则可使用从血液（血浆）标本中获得的ctDNA进行评估，尽可能明确最可能从EGFR靶向药物治疗中受益的NSCLC患者【8】。
1.ctDNA特征简介
ctDNA 通常是指由肿瘤细胞主动分泌或在肿瘤细胞凋亡或坏死过程中释放入循环系统中的 DNA 片段，长度 132~145 bp，半衰期较短（一般<2 h）。因此，ctDNA有可能携带来源于肿瘤细胞相关的遗传学特征，如基因突变、甲基化、扩增或重排等，可作为肿瘤筛查、伴随诊断、治疗疗效评估及预后风险分层的重要指标【9】。
但在肿瘤患者血液中，ctDNA 水平一般呈动态变化，且受多种因素影响：1）在肿瘤负荷较轻、特定部位（如颅内肿瘤）和特定组织学（如胶质瘤），以及增殖、凋亡和/或血管化水平较低的肿瘤患者中，ctDNA水平通常较低【9】。2）大量其他来源的 DNA 干扰。如其他正常细胞或白细胞来源的DNA，与ctDNA一起被称为游离 DNA（cell free DNA，cfDNA）。3）多种生理和病理因素，如怀孕、剧烈运动、外伤、炎症、心肌梗死、自身免疫性疾病和急性中风等也会影响ctDNA的释放【9】。4）克隆性造血细胞产生的cfDNA携带的基因突变信息可能会干扰ctDNA检测结果【9】。除此以外，还有多种因素导致ctDNA携带信息受到影响，其波动较大，在临床检测和报告解读中应尤为注意。
2.血液ctDNA标本处理规范
目前国内已开展的ctDNA NGS检测实验室中，质控回顾分析结果仍存在较多问题。因此，为推动ctDNA样本分子检测质量提高，2022年《ctDNA高通量测序临床实践专家共识》针对上述问题提出如下几点关键要点【10】：
2.1 实验室要求及体系构建
开展ctDNA样本的分子检测实验室应完全满足肿瘤二代测序实验室的总体设计与要求，如“各区独立，注意风向，因地制宜，方便工作”原则，配备相应实验仪器及分区实验场地。所有试剂耗材应优先选择获得NMPA三类医疗器械证的检测试剂和配套耗材，或至少选择经过性能确认的临床实验室自建项目（laboratory developed test，LDT）试剂替代。同时包括常规质控、试剂质检等体系验证。
2.2 样本收集、处理原则
全血中血浆和血清均能分离出ctDNA，但通过和相匹配的血清样本比较后发现，血浆中ctDNA有更高的检出率。因此，建议按照指南方法，采用国家药监部门批准的、大容量血浆游离DNA分离试剂盒来提取游离DNA。至少采集10 mL全血并进一步分离血浆【ctDNA高通量测序临床实践专家共识】。具体方法包括：
1）使用含有游离DNA保护剂及防细胞裂解保护剂的专用常温采血管采集全血，采集后轻摇混匀，常温（6-30℃）放置不超过5-7天；以足够的离心力将全血充分离心两次，分离出不含细胞成分的血浆，放置于-70℃冻存直至DNA抽提，或直接进入DNA抽提步骤。
2）用常规EDTA抗凝管（严禁使用肝素抗凝管）采集全血后，两小时内以足够的离心力将全血充分低温离心两次，分离出不含细胞成分的血浆，放置于-70℃冻存直至DNA抽提，或直接进入DNA抽提步骤。考虑到临床实践的方便性，建议尽量采用第一种方案采集10 mL全血。此外应注意，血浆分离过程中应注意避免吸入白细胞。
2.3 ctDNA在非小细胞肺癌中的应用
2.3.1 指导临床靶向用药及耐药监测 根据NCCN指南，对于具有相应基因突变的NSCLC患者可以采用相应的靶向药物治疗，如EGFR 21号外显子L858点突变和19号外显子缺失突变可以选择吉非替尼、奥希替尼等药物治疗。晚期NSCLC患者往往难以获得组织标本，此时可以应用ctDNA检测这些肺癌相关驱动基因的改变，从而指导临床靶向治疗。另外，ctDNA检测还可以有效地监测到治疗过程中出现的耐药基因，如EGFR-T790M，这样有利于临床医生及时调整治疗策略【11】。
2.3.2 肺癌的辅助诊断 采用二代测序方法检测ctDNA比ARMS法对于辅助诊断肺癌具有明显的优势。有研究通过CAPP-Seq方法检测13例肺癌和5例健康人外周血中的ctDNA，研究结果发现ctDNA对诊断II-IV期肺癌与I期肺癌的敏感性分别为100%和50%，特异性为96%，对于所有肺癌患者诊断的AUC值为0.89，该研究表明基于高通量的二代测序技术检测ctDNA中的肿瘤基因变异可用于诊断NSCLC【11】。
2.3.3 肺癌患者的预后评估 ctDNA检测是监测肿瘤基因组实时变化的一种有效手段，可以用于肺癌患者的预后评估。一项研究发现接受一线靶向治疗的晚期非小细胞肺癌患者进行ctDNA检测，发现具有KRAS基因突变的肺癌患者预后相对较差【12】。
2.3.4 预测早期NSCLC治疗后的早期复发 一项研究分析了88例NSCLC患者的363个系列血浆样本，采用外显子组测序鉴定体细胞突变，并使用患者特异性RaDaR分析了血浆。研究结果发现分别有24%、77%和87%的I、II和III期患者在治疗前检测到ctDNA，其中18/28(64.3%)的原发肿瘤临床复发患者在治疗后检测到ctDNA，这项研究表明使用敏感的检测方法对早期NSCLC患者进行初始治疗后的ctDNA检测有可能识别早期复发患者【13】。
2.3.4 检测微小/分子残留病灶【14】在早期NSCLC根治术后的辅助治疗中，微小/分子残留病灶（MRD）的检测结果指导术后辅助治疗可产生显著的临床相关性。国外一项研究采用CAPP-seqjiance ctDNA，在MRD出现36个月后，可检测到ctDNA的患者100%进展，而未检测到ctDNA的患者93%疾病无进展，MRD未检出ctDNA的患者远期生存率明显高于检测到ctDNA的患者。该研究表明治疗后ctDNA由阳性转阴性，预示手术或辅助治疗后可以清除MRD，从而改变其疾病进展和生存，而ctDNA继续呈阳性或由阴转阳，可能预示存在MRD，提示需要改变治疗方案。
小结
NSCLC发病率逐年升高，其中肿瘤基因突变鉴定诊断对NSCLC患者预后及靶向用药具有重要意义。随着检测技术的发展，在保证现有检测特异性和预测准确性的基础上，不断提高血液EGFR检测的灵敏度，将有助于整体上提高我国肺癌患者的EGFR基因受检率，从而使更多的患者接受精准的靶向治疗。
参考文献
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