编者按：膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，可分为非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌，后者易发生转移且5年生存率低。目前文献报道的膀胱癌的分子分型基于转录水平，缺少在蛋白质层面上的分型研究。基于此，由复旦大学和上海交通大学多个研究团队联合对中国116例膀胱尿路上皮癌进行了蛋白质组、基因组、转录组和磷酸化组等多个组学研究，发现了从NMIBC进展到MIBC的发挥作用的染色体改变，并确定了GARS可能是膀胱癌治疗的一个新的靶点。该研究为膀胱尿路上皮癌的进展机制和精准治疗提供了新的依据。该研究在线发表于最新一期《血液与肿瘤学》杂志上。为了让读者全面了解本文的研究内容，91360组织相关人员对该文的主要内容进行编译，以飨读者。
研究背景
膀胱癌是一种具有高度发病率和病死率的恶性肿瘤。膀胱癌最常见的病理类型是尿路上皮癌（UC），其中75%为非肌层浸润性膀胱癌（NMIBCs）和25%为肌层浸润性膀胱癌（MIBCs）。NMIBCs常复发并可进展为MIBCs，MIBCs5年生存率低、易进展和转移。
尽管NMIBC和MIBC的临床表现不尽相同，但它们具有相同的基因改变包括DDR、MAPK/ERK和ERBB家族基因等。UC的各种亚型如Lund分型、MDA分型、UNC分型和TCGA分型已被认识，这些亚型具有一定程度的生物学一致性和相似的临床特征。然而这些分类主要是基于转录组数据，蛋白质与表型直接相关，但基于UC蛋白质组学的分类还缺乏研究。基于蛋白质的分子分型有望提供关于将基因组信号转化为细胞功能的关键信息，因此迫切需要对UC进行全面的蛋白质组学分析。
为此，来自复旦大学和上海交通大学的多个研究团队联合对116例中国UC患者进行了蛋白组、基因组、转录组和磷酸化组测序，全面分析UC蛋白基因组学特征，分析蛋白组分型与预后、基因组改变和磷酸化组的相关性，为临床治疗寻找潜在靶点。
研究结果
一 UC标本的综合性蛋白基因组学特征
作者收集了116例UC及其配对的形态学正常的尿路上皮（MNU），UC包括45例NMIBCs和71例MIBCs。通过MutSig分析，筛选出具有统计学差异的体细胞突变基因24个，其中包括6个已知的膀胱癌相关基因：TP53 44%，KMT2D 25%，PIK3CA 19%，ARID1A 17%，RB1 5%和ELF3 4%。随后通过Sigminer方法确定了4种突变型，1-4型分别对应于已知的COSMIC分型：SBS5, SBS1, SBS30和 SBS13。研究发现代表基于DNA切除修复的SBS30具有最高水平的TMB，代表APOBEC活性的SBS13与预后不良相关。
二 拷贝数变化的影响
作者采用全基因组测序对113例肿瘤进行了体细胞拷贝数变异（CNA）的研究，发现25,961 CNAs对mRNA、蛋白质和磷酸化蛋白表达有影响。为了进一步在CNA区域内确定功能重要的基因，作者聚焦593个癌症相关基因（CAGs），其中在他们的队列中发现555个。发现在mRNA、蛋白质和磷酸化蛋白水平上共同正相关的基因有10个（RBL1, TPR, MTOR, IRF6, TBX3, RB1, PRKCD, MTUS1,CDK12和ERBB2）。
CNA分析还显示常伴有染色体1p, 1q, 3q, 5p, 7p, 7q, 8q, 17q, 19p, 19q, 20p和20q获得，和染色体4q, 5q, 8p, 9p, 9q, 10q, 11p, 11q, 18p和22 q缺失。他们发现5p和7q获得与不良的总生存期 (OS) 和无进展生存期 (PFS) 相关。还发现染色体5p（C9）和7q（SND1和ELN）上的基因与顺式效应编码的蛋白质水平显著正相关且与预后差相关，但与mRNA表达水平无关。进一步分析显示肿瘤中磷酸化STAT3与CDK5蛋白高表达呈正相关。通过这些研究他们确定了染色体7q的2种顺式效应，SND1和CDK5。SND1表达上调调控STAT3活性，而CDK5进一步磷酸化STAT3。
三 肿瘤和MNUs的整合多组学分析
作者比较了肿瘤和MNUs在不同组学层面上的差异，差异基因分析筛选出1726个mRNA，2676个蛋白和784个磷酸化蛋白。进一步富集分析显示，肿瘤在3个组学上均存在细胞周期通路上调和跨膜转运通路下调，提示肿瘤与MNUs在三组学都存在差异。膀胱尿路上皮特异性蛋白如UPK家族在肿瘤内下调，且肿瘤内UPK蛋白高表达的患者预后较好。进一步通路富集分析显示：在蛋白和mRNA水平上具有明显生存差异的相关基因参与了局灶性粘附、ECM受体相互作用和PI3K-Akt信号通路，提示关键信号通路异常与肿瘤发生和进展密切相关。肿瘤和MNUs的磷酸蛋白质组的激酶底物富集分析(KSEA)显示，在肿瘤内活化的主要激酶包括CSNK2A1、AURKA、VRK1、PRKDC、MAP2K7和ERBB2。
四 区分NMIBC和MIBC的蛋白基因组学谱
MIBC由于早期隐匿转移性播散而比NMIBC预后差。作者研究发现参与MIBCs富集通路的蛋白表达水平从低级别NMIBC、高级别NMIBC到MIBC逐渐增加，而参与NMIBC富集通路的蛋白表达水平逐渐降低。如功能上调控肌动蛋白细胞骨架的蛋白（EHD2，ELN，LCP1等）从低级别NMIBC、高级别NMIBC到MIBC逐渐增加，而氧化磷酸化和脂质代谢的蛋白（NDUFA7、CYP2J2、GPX2等）则逐渐降低， NMIBC和MIBC之间的这些差异也见于低级别NMIBC和高级别NMIBC中。
FGFR3突变较常见于NMIBCs，而TP53和RB1在MIBCs中显示较高的突变率。染色体水平上，染色体如5p、7p和20q获得主要见于MIBCs中。在显著差异的染色体水平CNA中，仅有5p获得在整个队列中与预后不良有关。但我们发现5p获得的预后差仅见于NMIBC，而不是MIBC中。进一步研究发现5p获得在MIBCs中的百分比（80%）明显高于NMIBCs（20%），提示5p获得在NMIBC到MIBC进展中发挥作用。这些研究显示5p获得在NMIBC到MIBC进展的潜在作用，其机制可能通过调控肌动蛋白细胞骨架参与了肿瘤细胞侵袭。
五 UC的蛋白质组学亚型和标签蛋白
共识聚类根据116例肿瘤30%以上中存在5489个蛋白确定了3种蛋白质组学亚型，分别为U-I型，U-II型和U-III型，它们具有独特的分子和临床特征。U-I型的OS和PFS最好，而U-III型的OS和PFS最差。结合临床资料，U-I型以乳头状和NMIBCs为主，而U-III型易发生神经侵犯、转移和血管侵犯。单因素Cox回归分析显示蛋白质组学分型是一个独立的预后因子。
亚组特异性通路富集分析显示这3个蛋白质组学亚群具有不同的特征，U-I型的特征为高水平的代谢相关通路，如丙酸代谢、脂质代谢过程和花生四烯酸代谢（CYP2J2、ALOX5、AKR1C3等）；U-II型与肿瘤增殖更相关，包括细胞周期（MCM2，ANAPC4、CHEK1等），RNA拼接和DNA修复；U-III型的特征为与细胞外基质分解、补体和凝血级联相关通路以及PI3K-AKT信号通路，其中一些与肿瘤环境和免疫反应有关。FGFR3标签（IRS1、FGFR3、PTPN13等）在U-I型中高度表达，而分化标签（PPARG，SPINK1，DHSR2等）在U-I型和U-II型中高表达。另外，tRNA氨酰化（GARS，PARS和TRAS）在U-II型中表达最高，EMT标签（TGFB1，VIM和CAV1），野生型p53标签（DES，FLNC，CNN1）和CSC标签（NES，CD47和THY1）在U-III组中过表达。
为了将这些发现直接转化为用于肿瘤分类的实验室检测，作者进行了差异表达分析和功能分析，识别出24个蛋白生物标志物，进行生存分析发现8个（CYO2J2，PRKCB、COL1A1等）与预后不良有关蛋白。随机选择3个蛋白标志物候选（CYP2J2、MLH1和PRKCB）来验证在特异性蛋白质亚型（U-I，U-II和U-III）的表达，结果与蛋白质组数据一致，证实PRKCB在U-III型中过表达，MLH1在U-II型中过表达，CYP2J2在 U-I型中过表达，这些蛋白可以作为一组候选的生物标志物在临床上应用于区分不同亚型。
本研究还将这3个聚类与先前的UNC分类进行比较，发现U-I型和U-II型与腔面亚型密切相关，而U-III型与基底样亚型匹配。与MDA分类比较显示，U-I型与腔面亚型匹配，U-II型与TP53样亚型匹配，而U-III亚组与基底亚型匹配。与TCGA分类比较，U-I型与腔面-乳头和腔面型匹配，U-II与腔面浸润型匹配，而U-III型与基底-鳞状型匹配。
基于蛋白激酶已被开发作为癌症治疗的可行药物靶点，研究者们接着进行激酶-底物富集分析，根据每种蛋白质亚型中不同含量的磷酸位点来推断激酶的活性。研究结果提示不同蛋白质组学亚型具有不同的激酶，可以采用相应的激酶抑制剂治疗。
六 UC肿瘤的免疫细胞浸润
作者基于116例肿瘤的蛋白质组学数据进行免疫和间质来源的标签研究，细胞标签共识聚类确定了2种NMIBC亚型和3种MIBC亚型，即冷-混合、冷肿瘤、代谢、细胞周期和热型肿瘤。冷型肿瘤显示低免疫和间质分数，高FGFR3、ART1突变率和9q34.3缺失率，mTOR信号和ERBB信号活化，以及内皮细胞和角质细胞富集。热型肿瘤免疫评分最高，免疫细胞包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和多能祖细胞等多种。蛋白质组学分析显示免疫相关通路包括JAK STAT信号上调和免疫逃避标记物CD40，WARS，SAMD9L，GBP1和GBP5。冷-混合型肿瘤表现为较强的前体B细胞，CMP和pDC标签。细胞周期型肿瘤特征为CD4+T细胞、CD4+记忆T细胞和Th1细胞，细胞周期和错配修复通路的上调。代谢型肿瘤一定程度上类似于热型肿瘤，并具有纤维母细胞和NKT细胞特征，代谢通路如组氨酸代谢和β-丙氨酸代谢上调。他们还发现9q34.3扩增明显与免疫评分呈正相关，多见于热型肿瘤。进一步研究发现TRAF2表达增高与PD-L1表达增加密切相关，并与病人对PD-L1抑制剂反应有关。
七 蛋白质组组学和磷酸化蛋白质组学相关的临床特征
为了以无偏倚的全蛋白质组方式探索我们队列的生物学特征，利用116个肿瘤中10%以上的蛋白质进行了加权相关网络分析（WGCNA）。共表达分析产生15个共识模块，其中ME红色模块明显与染色体5p获得有关。ME绿黄模块与血清白蛋白密切相关，后者与内吞、细胞间蛋白运输和囊泡介导运输有关。ME蓝色模块与OS明显相关，这个模块内的基因富集局灶粘附、补体和凝固级联和PI3K-AKT通路。
为了发现具有不同组织学变异的肿瘤在分子水平上的差异，作者使用基因集富集分析）GSEA）分析了蛋白质组学数据。结果显示代谢相关通路富集于乳头状癌，血管内皮上周因子受体信号和整合素介导的细胞粘附富集于非特殊性浸润性尿路上皮癌中。而且，研究发现不同的分化亚型与不同的通路和活化的激酶相关，为个性化治疗的需要提供了证据。
结论
本文首次描绘了中国人群UC的蛋白质组学谱，发现5p获得作为一种关键因子参与了NMIBC到MIBC的进展。而且，基于蛋白质组学的UC分类结合多组学数据揭示每个亚组的分子标签及其特异性激酶。UC的免疫亚型分析显示9q34.3扩增与较高的PD-L1表达相关。最后，他们发现GARS通过抑制PGK1和PKM2增强磷酸戊糖通路流动而促进了人类膀胱癌细胞系T24和5637的进展，这些结果提示GARS可能是UC的一种新的治疗靶点。
文献来源:Xu N, Yao Z, Shang G, et al. Integrated proteogenomic characterization of urothelial carcinoma of the bladder. J Hematol Oncol, 2022, 15(1):76.
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