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近十年来，晚期非小细胞肺癌的治疗，尤其是靶向治疗，取得了极大的进展，分子分型是非小细胞肺癌实施靶向治疗的前提。目前，选择准确、快速、恰当的检测方法，全面筛选出适用的靶向药物的目标人群具有重要意义。本文就在非小细胞肺癌常见的基因异常表现及检测方法做一阐述，以期在临床病理检测中选择最优方法，使患者获益。
NCCN指南推荐晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者常见的基因异常类型为基因突变、基因过表达、基因融合等。一般情况下都应当进行肿瘤组织或脱落癌细胞的EGFR、ALK突变检测，以明确靶向药物的敏感位点和可能存在的耐药情况。对EGFR和ALK突变阴性的NSCLC患者可尝试进行ROS-1、c-MET、RET、KRAS及BRAF的基因检测[1]。
在NSCLC中，常见的基因改变类型有：1.EGFR基因变异类型：EGFR基因变异包括基因突变（点突变、插入/缺失突变），主要发生在编码EGFR酪氨酸激酶区的第18~21号外显子，以及获得性耐药突变（包括第一、二代TKI 的耐药突变T790M 和第三代TKI 的耐药突变C797S 等）。EGFR 基因扩增对选择TKI 治疗目前无明确临床意义。2. ALK基因变异类型：ALK基因变异类型包括基因重排/融合，以及获得性耐药突变（点突变为主）。目前至少发现了20 多种EML4-ALK 融合变异亚型。此外还有更多少见/罕见的ALK融合伴侣不断被发现。3. ROS1 基因变异类型：ROS1 基因变异包括ROS1基因重排。目前共发现十余种ROS1基因融合伴侣，主要包括CD74、SLC34A2、CCDC6、TPM3、EZR等，其断裂位点主要位于ROS1基因的第32~36号外显子。5.MET 基因变异类型：在NSCLC 的临床实践中，根据已有的循证医学证据，目前主要关注MET第14号外显子跳跃突变和MET扩增的检测。6. 除此以外，HER2、BRAF、KRAS、RET、NTRK等：除了上述靶分子外，HER2基因突变或扩增、BRAF突变、KRAS 突变、RET 基因重排、NTRK 家族基因重排等，均为NSCLC中重要的驱动基因变异，并是潜在的治疗靶点。7. PD-L1表达检测：通过IHC检测肿瘤细胞和/或免疫细胞PD-L1的表达水平是目前判断NSCLC患者能否从免疫检查点抑制剂治疗中得到更多获益的主要评估手段。
针对不同的突变类型，临床中需用到不同的检测方法，以获得最精准的结果。常用分子病理检测方法主要特点比较见表1。常见的基因改变检测方法：1）点突变、插入/缺失：主要是EGFR L858R、EGFR-19del、EGFR T70M和EGFR-E20ins，是基于DNA水平上的改变，临床上常用的检测方法有ARMS-PCR、NGS、dPCR等。主要包括EGFR最主要的突变位点外显子19缺失（19del）和外显子21点突变（L858R），同时还包括外显子18点突变（G719X），外显子20插入突变（20ins）和点突变（T790M、S768I），外显子21 点突变（L861Q）等。对于这些已知突变，组织样本推荐采用ARMS-PCR法，检测时间短且检测费用相对较低。基于qRT-PCR 的方法，需要根据EGFR基因已知的突变类型设计引物探针，无法检测出所有可能的突变，但灵敏度相对较高，操作简单，无需对PCR产物进行操作，在很大程度上避免了扩增产物的污染，易于在临床开展，是目前EGFR 基因突变检测最常用的检测技术之一。二代测序是一种高通量测序技术，能够同时对多基因、多位点进行测序。二代测序检测EGFR基因突变，检测位点更加全面，可以发现罕见突变位点，为晚期NSCLC患者的全流程管理提供依据。2）基因重排/融合：涉及到的基因主要由ALK、ROS1、RET等，可以采用的检测方法有免疫组化、FISH、ARMS-PCR和NGS。ALK Ventana D5F3 IHC检测方法是目前最快速、经济的方法。该判读标准仅适用于肺腺癌，该检测在用于鳞癌、神经内分泌癌等其他类型肺癌标本时应谨慎，疑似阳性标本需要使用其他方法进行验证。FISH检测是检测ALK重排的“金标准”，检测结果判读直观，对样本质量要求较低，但费用较高、经济效益比不佳。并且在FISH判读时，对于处于临界值分离信号、不典型分离信号等的判定需要格外谨慎，推荐利用其他技术平台复核检测。基于qRT-PCR方法的ALK融合基因检测具有较高的灵敏度和特异度，但因为qRT-PCR 只能检测已知ALK 融合基因类型，所以存在假阴性。另外，由于qRT-PCR基于mRNA扩增技术，因此实验室内、外部质控等应制定最严格的技术标准，防止污染。二代测序对ALK基因融合通过捕获平台在DNA/RNA水平或扩增子平台在RNA水平上进行检测。但对于质控不合格或结果不典型病例，报告时应加备注，并建议使用其他技术平台进行复检。同时当二代测序在血液中检出ALK基因变异时，应注意假阴性结果的出现。3）基因重排：ROS1基因重排/融合表达检测各种方法学与ALK 相似，但IHC抗体特异性不佳，目前不能直接用于检测ROS1基因重排/融合表达，仅可用于ROS1基因融合初筛。基于qRT-PCR方法的ROS1融合基因检测具有较高的灵敏度和特异度，且可与ALK联检。FISH检测是检测ROS1重排的“金标准”。二代测序检测ROS1基因变异同样可在DNA水平上检测重排序列，也可在mRNA水平检测融合序列，但由于ROS1基因序列的特殊性，基于DNA水平的二代测序检测灵敏度受文库探针设计及生物信息学分析能力影响较大，应注意假阴性。4）跳读突变：MET第14号外显子跳跃突变的检测，包括二代测序或qRT-PCR直接检测缺失MET第14号外显子的mRNA，或二代测序在DNA 水平上检测可能导致MET第14号外显子剪切的基因变异。MET 基因探针覆盖范围不够可能导致基于DNA的二代测序发生漏检，建议二代测序检测应尽量涵盖第14号外显子外的如第13或14号内含子上可能发生剪切变异的区域。原位杂交检测是检测MET扩增的标准方法。相较于FISH，二代测序可用于MET扩增检测，但与FISH检测的对应性比较复杂，并可能遗漏MET多体，但是二代测序可同时检测MET突变和融合等其他变异，且能实现多基因共检，在临床实践中应用更广。5）蛋白过表达：NSCLC中蛋白过表达可用于指导临床靶向治疗的基因有HER2、NTRK和PD-L1，通过IHC检测肿瘤细胞和/或免疫细胞PD-L1的表达水平是目前判断NSCLC患者能否从免疫检查点抑制剂治疗中得到更多获益的主要评估手段。目前我国已批准3种标准化的PD-L1检测商用试剂盒用于临床检测，包括配套Dako平台的PD-L1 IHC 22C3 pharmDx试剂盒及浓缩液、PD-L1 IHC 28-8 pharmDx 试剂盒以及配套Ventana检测平台SP263试剂盒。不同单抗和IHC染色平台的使用、PD-L1染色阳性截断值的设定与相应的免疫治疗药物疗效相关。PD-L1 检测所用抗体克隆不同其阳性阈值不同。除了上述靶分子外，HER2基因突变或扩增、BRAF突变、KRAS 突变、RET 基因重排、NTRK 家族基因重排等的检测方法可参照基因点突变、基因重排类型的检测方法和检测策略，更多的尚需临床实践的积累。
表1 非小细胞肺癌常用分子病理检测方法主要特点比较
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