HNF1β是卵黄囊肿瘤敏感而特异的新标记物:601例睾丸生殖细胞肿瘤的组织芯片分析

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  肝细胞核因子1β(HNF1β)是一种转录因子,在早期器官发生,特别是胰胆管和泌尿生殖道的发育中起重要作用。此外,HNF1β是卵巢癌鉴别诊断的标志物,在卵巢透明细胞癌亚型中有明显的核表达。最近,有研究人员阐释了HNF1β在卵黄囊瘤中的表达。卵黄囊瘤是许多非精原细胞瘤的常见成分。由于其广泛的组织学多样性,诊断具有挑战性的,辅助诊断对生殖细胞肿瘤的确诊是非常有帮助的。应用免疫组织化学方法检测精原细胞瘤、胚胎性癌、卵黄囊瘤、绒毛膜癌、畸胎瘤、原位生殖细胞肿瘤和正常睾丸组织中HNF1β的表达情况。将其表达模式与目前用于卵黄囊瘤检测的两种标志物——Glypical3(GPC3)和α Fetoprotein(AFP)进行了比较。HNF1β与GPC3和AFP的胞浆着色相比,显示出明显的核染色。HNF1β的敏感性和特异性分别为85.4%和96.5%,GPC3为83.3%和90.7%,AFP为62.5%和97.7%。我们的结论是,HNF1β可以可靠地将卵黄囊瘤与其他生殖细胞肿瘤成分区分开来。因此,我们建议将HNF1β作为睾丸生殖细胞肿瘤免疫组化鉴别的一种新的、有效的标记物。
  引言
  睾丸生殖细胞肿瘤(GCT)仅占男性所有肿瘤的1%。然而,它们却是睾丸中最常见的肿瘤。由于它们主要好发于生育期的青年男性,因此成为一个重要的实体瘤。2016年WHO将TGCT分为两大组,即原位生殖细胞肿瘤(GCNIS)(青春期后GCT)或非原位生殖细胞肿瘤(精母细胞性肿瘤、青春期前畸胎瘤和卵黄囊瘤(YST))。因临床治疗不同,瑞士苏黎世大学医院病理与分子病理科将GCNIS来源的睾丸GCT进一步分为两大类:精原细胞瘤和非精原细胞GCT。后者又细分为未分化成分(胚胎癌)、有胚胎分化成分(畸胎瘤)和胚外分化成分(绒毛膜癌和YST)。由于这种异质性,不同亚型之间的形态重叠在日常诊断中可能会面临挑战。尽管如此,准确的组织病理学诊断对于患者的进一步治疗是至关重要的。为了提高诊断的准确性,免疫组织化学作为一种有价值的辅助工具需要应用于诊断中。
  在所有的GCT亚型中,YST形态学谱系最广,已有10多种组织模式被描述。这种肿瘤的组织学类型多样性更加突出了可靠标记物的重要性。目前的诊断推荐α-Fetoprotein(AFP)和Glypical-3(GPC3)作为YST标记物,但它们的敏感性和特异性并不理想。最近,Rougeont等报道了45例睾丸和卵巢GCT中肝细胞核因子1β(HNF1-β)的表达情况,认为其是诊断YST的一种敏感而可靠的标记物。
  我们研究的目的是评估HNF1β在超过600例睾丸GCT大队列中的表达,并比较其和现有标记物AFP和GPC3之间敏感性和特异性的差异。
  1 材料与方法
  1.1  病人选择  601例睾丸GCT石蜡切片(1990~2014年,平均年龄36岁)来源于瑞士苏黎世大学医院病理与分子病理科档案室。两位专门从事睾丸病理诊断的病理医生(AG,PKB)重新评估了切片,并根据2016年WHO分类对肿瘤进行了分类。其中单纯精原细胞瘤392例(65.2%),非精原细胞瘤147例(23.6%),混合型精原细胞与非精原细胞瘤58例(9.7%),精母细胞性肿瘤4例(0.7%)。
  1.2  组织芯片  用组织芯片创建组织微阵列(TMA)。每个肿瘤取2个直径为0.6 mm的组织芯。在混合型GCT中,每种亚型分别打孔2次,以反映肿瘤的异质性。TMA包括精原细胞瘤450例,胚胎性癌123例,卵黄囊瘤48例,畸胎瘤42例,绒毛膜癌8例,精母细胞性肿瘤4例,来自邻近睾丸组织的原位生殖细胞肿瘤(GCNI) 24例。此外,非肿瘤性睾丸组织来自35名因不育而接受程序性诊断的患者。在处理过程中,有17个组织芯丢失。总共分析了1451个睾丸组织的芯片。
  1.3  完整切片  除TMA外,选取15张GCT的切片,其中至少含有20%的YST成分,分析不同生长模式下的免疫组化染色情况。其中原发肿瘤9例,转移瘤6例。所选的蜡块涵盖了最常见的生长模式:微囊-网状、大囊、实性、腺状和肝样。如果其中一个病例表现出不同的生长模式,则分别对每种模式进行分析。详见表2。
  1.4  组织学和免疫组织化学  将3μm厚的TMA切片置于载玻片上(SuperFrost Plus;Menzel,Braunschweig,德国),脱蜡,水化,用苏木精和伊红按标准方案染色。
  HNF1β多克隆抗体(Sigma Chemical Company,稀释度1:2 0 0) 为Sigma公司产品。采用Leica Bond III255染色机进行免疫染色。阳性对照组织为正常肾、肝、肺、前列腺和脑组织。着色区域为细胞核。GPC3的克隆号为1G12(DCS Immuno Line,稀释度1:100)。以几种细胞系(髓细胞系Marimo;人卵巢腺癌细胞系Ovcar-3;人黑色素瘤细胞系SKMel-30;人肝细胞细胞系HepG2;人结肠腺癌细胞系SW480)的石蜡包埋块作为阳性对照。GPC3染色模式为细胞膜和/或细胞浆。AFP采用多克隆抗体(DAKO,稀释度1:1000)。以胎肝组织作为阳性对照。阳性组织多呈颗粒状胞浆染色。有时可观察到强烈的非特异性背景染色,特别是在坏死和囊性区域,这是分泌性蛋白的特征。这种背景反应不能被认为是阳性的。
  两种染色(GPC3和AFP)均在Ventana Stainer平台上结合OptiView DAB试剂盒进行。两位病理医生(AG、PKB)使用成像软件(Hamamatsu的NanoZomer)对微点阵列进行数字化评估。组织核芯分为阳性病例和阴性病例。所有核芯成分中>5%阳性细胞(按上述染色模式)则定义为阳性。如果两个打孔的肿瘤中一个核心成分是阳性的,而另一个是阴性的,那么这个病例也被认为是阳性的。
  2 结果
  2.1  HNF1β免疫组化  由于HNF1β的核染色呈中度至强阳性,因此易于评价其表达情况。总体而言,在48例YST中,有31例呈均一的染色阳性(31/48)(两个组织核芯均阳性),10例呈非均质性的染色阳性(10/48)(只有一个组织核芯阳性),7例为阴性。在其他非精原细胞瘤组织中,24例HNF1β呈弱至中度表达。所有精原细胞瘤、精母细胞性肿瘤、GCNIS和非肿瘤性睾丸组织样本均为阴性。HNF1β的敏感性为85%(95%CI为0.7162~0.9345),特异性为96.5%(95%CI为0.9476~0.9770)。
  2.2  GPC3免疫组化  与HNF1β相比,GPC3的染色模式为膜和/或胞浆。由于背景染色较弱,只有中等到强的染色才被认为是阳性的。48例YST中有32例或多或少呈阳性均一染色(32/48)(两个组织核芯均阳性), 8例呈非均质性染色阳性(8/48)(只有一个组织核芯呈阳性),8例为阴性。在非YST患者中,GPC3呈弱至中度表达,其中胚胎性癌57/123例、畸胎瘤1/42例、绒毛膜癌6/8例。值得注意的是,27/450例精原细胞瘤和16/25例GCNIS显示了一种淡染的均匀染色模式,这是非特异性背景,被认为是阴性。GPC3的敏感性为83.3%(95%CI为0.6923~0.9203),特异性为90.7%(95%CI为0.8818~0.9269)。
  2.3  AFP免疫组织化学  AFP具有典型的颗粒状胞浆表达。在我们的研究中, 48例YST中有20例呈阳染色(两个核芯均阳性),有10例呈非均质性染色(只有一个核芯阳性),18例为阴性。AFP在123例胚胎性癌中有11例阳性,42例畸胎瘤中有3例阳性,8例绒毛膜癌中有2例阳性。精母细胞性肿瘤、精原细胞瘤和GCNIS均为阴性。甲胎蛋白的敏感性为62.5%(95%CI为0.4733~0.7567),特异性为97.7%(95%CI为0.9616~0.9862)。结果见表1和图1。
表1  GPC3、AFP和HNF1β在生殖细胞肿瘤、原位生殖细胞肿瘤和正常睾丸组织中的表达

  图1 非精原细胞瘤组织学(第1栏)及GPC3(第2栏)、AFP (第3栏)和HNF1β(第4栏)的表达模式。A卵黄囊瘤(YST)。B胚胎性癌(EC)。C畸胎瘤(肠道分化)。D绒毛膜癌(CC)。GPC3在YST(A2)中阴性表达。EC表现为弱的胞浆染色(B2)。畸胎瘤中阴性表达(C2)。CC为散在弱阳性的合体滋养叶细胞(D2)。YST(A3)中AFP呈强弥漫性阳性。EC(B3)、畸胎瘤(C3)和CC(D3)均为阴性。HNF1β在YST(A4)中有强的核表达。EC无核染色(B4)。畸胎瘤伴肠道分化的腺体表现出明显的核染色(C4)。CC细胞胞浆弥漫性染色(D4)。所有图像×200倍放大。
  2.4 整张切片  半定量评价:均一表达(>50%阳性细胞),非均质性表达(5-50%阳性细胞),散在单个细胞(<5%阳性细胞)。
  除了在实体型YST中呈非均质性表达外,HNF1β在所有病例中均有较强且均一的表达。而GPC3和AFP则表现出不均匀的染色模式,有时仅有散在的阳性细胞。在1例(淋巴结转移)GPC3、AFP均为阴性。结果汇总在表2和图2中。
  表2  整个切片:GPC3、AFP和HNF1β在卵黄囊瘤不同生长模式中的表达
  ++均一表达(>50%阳性细胞),+非均质性表达(5~50%阳性细胞),(+)散在阳性细胞
  图2 HNF1β在YST不同生长模式中的表达。A 在YST强阳性表达及在胚胎性癌中阴性表达。B大囊型。C型肝样。D实体型。E腺样型。F微囊型/网状型。所有图像×100倍放大。
  讨论
  在这项超过600例睾丸的GCT中,我们分析了HNF1β在睾丸YST和非YST成分中的表达,并与常用的推荐标记物AFP和GPC3进行了比较。我们发现HNF1β与GPC3的敏感性(85.4%比83.3%)和AFP特异性(96.5%比97.7%)相当。然而,HNF1β的敏感性(85.4%)高于AFP(62.5%),特异性略高于GPC3(96.5%对90.7%)。
  青春期后睾丸GCT可表现出明显的异质性,包括精原细胞瘤、胚胎癌、YST、绒毛膜癌和畸胎瘤。不同类型的正确诊断和量化对进一步的治疗有重要影响。不同肿瘤亚型之间的形态重叠对诊断来说是一重大挑战。事实上YST以其多样的形态而闻名。WHO目前的分类列出了11种不同的生长模式:微囊型/网状型、粘液瘤型、大囊型、实体型、腺型/肺泡型、内胚窦型/血管周型、肝样型、乳头型、肉瘤型/梭形细胞、顶浆型和多囊卵巢型。它们都可以合并出现,并且可以模拟其他GCT样生长。具体来说,实体型和腺样型可能很难与胚胎性癌相区别,而胚胎性癌的表现更具侵袭性,可能需要更激进的治疗。因此,在疑难病例中推荐采用免疫组织化学方法。
  目前,AFP和GPC3是最具特征性的YST标记。在发育过程中,AFP由卵黄囊分泌。到目前为止,AFP仍是YST的金标准标志物,并与相应的血清水平相关。因此,它是GCT患者临床检查和随访不可或缺的一部分。然而,AFP可能不是最佳的标记物,因为在非肿瘤性和肿瘤性肝脏疾病患者中也可以检测到相关的血清AFP亚型。AFP免疫组织化学显示为颗粒状胞浆染色的异质性模式。与AFP相比,GPC3已被证明是诊断YST的一个更敏感的标记物,尽管其表达模式也是多样的。有趣的是,与AFP相似,GPC3也可以在肝脏肿瘤和其他非睾丸肿瘤中表达。
  HNF1β是一种核蛋白,是含有同源结构域的转录因子超家族成员。之前报道在胎儿的肝、胰、胃、肺和肾中表达,这表明它在这些器官的发育中可能起到了作用。HNF1β突变可导致年轻人的肾囊肿和成人期糖尿病(MODY5)。Rebouissou等提示HNF1β胚系突变易发生肾肿瘤,并提出了HNF1β作为肾脏嫌色细胞癌的抑癌基因。此外,还描述了HNF1β多态性与前列腺癌易感性的可能关联。Kato等报道了HNF1β不仅在卵巢透明细胞癌中过表达,而且在子宫内膜异位症中也有过表达。在这两种肿瘤中,研究者都观察到凋亡的减少,这表明HNF1β可以激活凋亡抑制途径。在临床病理中,HNF1β是目前用于检测卵巢透明细胞癌的标志物。有趣的是,YST的体细胞亚型可以出现在卵巢的透明细胞癌中,两者均表达HNF1β。基于这一发现,Rougemont 和 Tille研究了45例睾丸和卵巢YST中HNF1β的表达。在他们的研究中,敏感性为100%,特异性为80%。总之,根据其提供的数据显示,他们认为HNF1β是YST的一个可靠标记。
  在我们的研究中,我们集中分析了HNF1β、AFP和GPC3在睾丸GCT中的表达,以明确每个标记物的特异性和敏感性。我们选择了TMA的方法,使得我们能够观察600多例肿瘤。YST中HNF1β表达率为85.4%,而GPC3和AFP的表达率分别为83.3%和62.5%。特异性分别为96.5%(HNF1β)、90.7%( GPC3)和97.7%(AFP)。16例畸胎瘤、7例胚胎癌和1例绒毛膜癌中也检测到HNF1β的表达(表1和图1)。畸胎瘤中HNF1β阳性仅见于成熟成分,而在未成熟成分中未见表达,特别是在有肠道分化的腺体中,这与Rougeont和Tille的研究结果一致。在HNF1β阳性的胚胎性癌中,仅有少数细胞呈阳性。有趣的是,GPC3免疫染色在这些病例中也呈阳性,提示以前可能有未检测到YST的小病灶。唯一一例HNF1β阳性的绒毛膜癌病例在背景胞浆中显示弱的核染色,这与Rougeont和Tille在他们的绒毛膜癌病例中观察到的染色模式是一致的。
  与HNF1β相比,GPC3在46.3%的胚胎癌和75%(6/8)的绒毛膜癌也有染色。在这些病例中,与YST相比,染色强度一般为弱至中度,而YST呈现中度至强的GPC3染色。因此,GPC3的特异性不及HNF1β或AFP。其他研究中也报道了相似的结果。在本研究中,AFP的特异性略高于HNF1β(97.7%比96.5%),但敏感性较低(62.5%比85.4%)。此外,HNF1β表达在细胞核,这使得它比AFP和GPC3免疫组织化学中所见的胞浆和膜染色模式更容易评估。这对于YST中的非常小病灶的更便于检测。
  值得注意的是,Rougemont 和 Tille在他们的研究中描述了HNF1β100%敏感性,但免疫染色是在整张切片上完成的。我们敏感度较低的原因可能是TMA的方法,由于抽样误差和肿瘤异质性,该方法可能低估了真实的阳性率。因此,我们在整张玻片上额外研究了15例含有相当比例YST的GCT,以分析不同YST生长模式下HNF1β的异质性。事实上,在所有病例(原发肿瘤和转移瘤)中,我们都可以看到HNF1β的表达很强且相当均匀,但在实性的YST中,只有不到50%的肿瘤细胞呈阳性表达。相反,AFP和GPC更多地表现为不均匀染色。然而,受研究病例所限,我们不能分析所有报道的YST生长模式。因此,尽管TMA法可以检测更多的病例,但我们的研究仍然受到TMA方法上的限制。
  这里还存在一些局限性。首先,我们主要检测的是未经治疗的肿瘤。化疗后,由于肿瘤的退变和持续存在的特殊的生长模式,形态学可能更难解释。此外,治疗后蛋白质表达会发生变化。例如,CD30可能在化疗后的胚胎癌中丢失。其次,我们的TMA队列由原发性肿瘤组成。有时睾丸GCT主要表现为转移或复发。在这种情况下,正确的诊断可能具有挑战性,因为它与其他肿瘤实体(如癌)的形态重叠。第三,GCT中出现的体细胞恶性肿瘤不在我们的研究范围内。因此,需要进一步研究HNF1β的表达,以进一步阐明HNF1β在上述三种情况下的诊断价值。
  综上所述,我们研究了600多个睾丸生殖细胞瘤中HNF1β的表达。与常用的YST标记物AFP和GPC3相比,HNF1β免疫组化比AFP有更高的敏感性,比GPC3有更高的特异性。此外,核表达模式更易评估。因此,我们认为HNF1β是诊断睾丸YST的可靠标记物,建议将其加入睾丸YST免疫组化的鉴别诊断中。
  原文出处:Gallo A, Fankhauser C, Hermanns T, et al. HNF1β is a sensitive and specific novel marker for yolk sac tumor: a tissue microarray analysis of 601 testicular germ cell tumors. Mod Pathol, 2020, Jun 19. doi: 10.1038/s41379-020-0597-x.
责任编辑: 奶糖
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