HER2免疫组化数字成像分析的验证研究及其与乳腺癌HER2 FISH结果的相关性

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  背景:
  Visiopharm人表皮生长因子受体2 (HER2)数字成像分析(DIA)算法通过测量细胞膜连接来评估数字化的HER2免疫组化(IHC)。我们的目的是通过与病理学家的评分进行比较以及与HER2荧光原位杂交(FISH)结果的相关性来验证该算法的临床应用价值。
  材料和方法:
  研究队列由612例连续的浸润性乳腺癌标本组成,包括395例穿刺和217例切除标本。使用Philips IntelliSite Scanners扫描HER2 IHC切片,使用Visiopharm HER2 – CONNECT App分析数字图像,获取连接值(0 - 1)和得分(0,1+,2+和3+)。比较HER2 DIA评分与病理学家的手工评分以及HER2连接值与HER2 FISH结果的相关性。
  结果:
  HER2 DIA评分与病理学家评分的一致性为87.3%(534/612)。所有不一致的病例(n=78)仅有一步不一致(阴性到不确定,不确定到阳性,或者反之亦然)。5例(0.8%)的HER2 IHC DIA与HER2 FISH结果不一致,但是这些病例的HER2拷贝数相对较低(4~6之间)。HER2 IHC连接值与HER2拷贝数的相关性明显优于HER2/CEP17比值。
  结论:
  HER2 IHC DIA与病理学家的评分具有良好的一致性,能准确区分HER2 FISH阳性和阴性病例。HER2 IHC连接值与HER2拷贝数的相关性明显优于HER2/CEP17比值,提示HER2拷贝数在预测HER2蛋白表达和抗HER2靶向治疗反应方面可能更加重要。
  引言
  大约高达20%的乳腺癌中发生人表皮生长因子受体2(HER2;ERBB2)基因扩增和/或蛋白过表达。曲妥珠单抗和帕妥珠单抗等抗HER2靶向药物对HER2阳性乳腺癌有效,但是对HER2阴性乳腺癌无效。考虑到抗HER2药物的副作用和高额花费,在向任何乳腺癌患者提供抗HER2药物之前,必须准确确定HER2的阳性状态。通常通过免疫组化(IHC)评估HER2蛋白表达和/或通过荧光原位杂交(FISH)评估HER2基因扩增来确定HER2状态。美国大多数实验室首先使用IHC,对于IHC不确定病例使用FISH进行反射测试。病理学家以非定量的方式评估HER2IHCs,并根据HER2蛋白的膜性染色给出从0到3+的评分。尽管美国临床肿瘤学协会和美国病理学家协会(ASCO/CAP)出版了关于如何评估HER2 IHC的指南,但是观察者之间的差异确实存在。
  自从广泛使用全载玻片成像(WSI)以来,数字图像分析(DIA)已经成为一种客观、可重复的评分方法,以定量的方式评估HER2 IHC。研究表明,DIA可以减少HER2 IHC的不确定病例。ASCO/CAP HER2指南承认DIA作为一种诊断程序,可以用于HER2状态的评估,并且CAP已经创建指南,以促进将HER2 DIA应用于常规病理学工作流程。
  Visiopharm HER2 IHC DIA算法评估细胞膜连接,初步数据表明,其可以准确评估乳腺癌和胃/食管腺癌中的HER2 IHC。我们的目的是通过与病理学家的评分进行比较以及与乳腺癌HER2 FISH结果的相关性,验证这种DIA算法的临床应用价值。
  材料与方法
  病例选择

  本研究选择2016年1月1日至2017年1月31日来自俄亥俄州立大学韦克斯纳医学中心的612例连续的原发性浸润性乳腺癌病例。俄亥俄州立大学的机构审查委员会批准使用人类材料。
  免疫组织化学
  根据制造商协议(Roche Ventana Medical Systems, Tucson, AZ),在Benchmark XT自动玻片染色仪上,使用PATHWAY anti HER2 (4B5)进行HER2 IHC。自动脱蜡步骤后进行细胞调节,然后用预先稀释的抗HER2兔单克隆一抗(克隆4B5)在37℃条件下冲洗孵育。冲洗后,使用超微通用DAB检测试剂盒(Roche Ventana Medical Systems, Tucson, AZA)观察染色情况。将载玻片复染,然后冲洗,加盖玻片。
  病理学家评分
  根据ASCO/CAP指南,由亚专科乳腺病理学家人工地对HER2 IHC进行评分:0(阴性):≤10%的肿瘤细胞无染色或染色微弱/几乎不可见,不完全的膜染色;1+(阴性):>10%的肿瘤细胞染色微弱/几乎不可见,不完全的膜染色;2+(不确定): >10%的肿瘤细胞呈弱/中度完全膜染色;3+(阳性): >10%的肿瘤细胞圆周完全强的膜染色。
  图像采集和数字成像分析
  使用Philips UltraFast Scanner (Philips,the Netherlands),在单聚焦层40倍放大条件下扫描玻片。用聚焦点自动检测载玻片上的组织,来获得最佳图像。全部切片图像存储在俄亥俄州立大学校园的中央服务器上。在Visiopharm Integrator System(Visiopharm, H rsholm,Denmark)上,运用HER2CONNECT算法评估HER2 IHCs,并记录从0到1的数值[图1]。
  HER2 DIA评分分为四类,cutoff值如下:(1)0:连接值= 0;(2)1+: 0 <连接值≤0.12;(3)2+: 0.12 <连接值≤0.49;(4)3+:连接值>0.49。与病理学家使用的HER2评分相似,根据初步分析和先前报道的数据,HER2 DIA评分定义:0和1+为阴性,2+为不确定,3+为阳性。
  图1:Visiopharm人表皮生长因子受体2免疫组化算法分析人表皮生长因子受体2免疫组化和连接。(a和b)人表皮生长因子受体2免疫组化1+的1例;(c和d) 1例人表皮生长因子受体2免疫组化2+。(e和f) 1例人表皮生长因子受体2免疫组化3+。(a,c和e)人表皮生长因子受体2免疫组化;(b,d和f) Visiopharm检测人表皮生长因子受体2连接(绿色线)。
  荧光原位杂交
  我们的机构使用带有CEN17探针的双色Vysis FDA批准的PathVysion HER2 DNA Probe Kit(Abbott Molecular, Des Plaines, IL)进行FISH分析。使用适当的滤光片,在荧光显微镜下观察HER2基因和CEN17的信号。记录至少50个细胞的HER2和CEN17的平均信号数,并计算每个病例的HER2/CEN17比值。由专门的分子病理学家进行结果的解释,并由专门研究乳腺病理学的病理学家签字认可。
  统计分析
  用百分率和描述性统计学总结所有的临床病理数据。将HER2 DIA值与配对的HER2拷贝数/比值进行比较,来评估相关性(Pearson相关性)。使用GraphPad Prism(SanDiego,CA)计算Kappa系数来衡量DIA评分与病理学家评分的一致性。这个计算使用线性权重。kappa结果解释如下: ≤0为不一致;0.01-0.20为无至轻微;0.21-0.40为一般;0.41-0.60为中等;0.61-0.80为实质的; 0.81-1.00为几乎完全一致。使用cocor网站()的cocor分析,比较HER2 IHC连接值与HER2拷贝数或HER2/CEP17比值的相关性。使用SAS 9.3版(SAS Institute, Cary, NC, USA)进行其他统计分析。所有结果以P < 0.05有统计学意义。
  结果
  研究队列的人口统计学特征

  研究队列包括612例浸润性乳腺癌,包括496例浸润性导管癌,65例浸润性小叶癌,25例混合导管/小叶癌,7例化生癌,19例腋窝淋巴结转移癌[表1]。432例HER2免疫组化评分为0或1+(阴性),101例为2+(不确定),79例为3+(阳性)。根据2013年HER2指南,101例HER2 2+病例,FISH结果为:49例未扩增,41例不确定,11例阳性。根据2018年指南,90例FISH呈阴性,11例FISH呈阳性。
  IDC:浸润性导管癌,ILC:浸润性小叶癌,HER2:人表皮生长因子受体2,ER:雌激素受体,PR:孕激素受体,IHC:免疫组化
  人表皮生长因子受体2免疫组化数字成像分析评分与病理学家评分的相关性
  使用Visiopharm的HER2膜算法分析每张HER2 IHC WSI切片,并记录HER2连接值。448例为阴性(0/1+),85例为不确定(2+),79例为阳性(3+)。HER2 DIA评分与病理学家评分相关,78例结果不一致,包括25例病理学家-阴性/Visiopharm-不确定,41例病理学家-不确定/Visiopharm-阴性,6例病理学家-不确定/Visiopharm-阳性,6例病理学家-阳性/Visiopharm-不确定。所有不一致的病例(n=78)仅为一步不一致(从阴性到不确定/从不确定到阳性,反之亦然)(表2)。HER2 DIA和病理学家评分之间的一致性是“实质性的”(kappa = 0.713,加权kappa = 0.797,87.3%)。HER2 DIA将HER2 IHC不确定病例从101例降至85例(16%)。
  HER2 DIA评分分为四类,临界值为:0:连接值=0;1+: 0<连接值≤0.12;2+: 0.12<连接值≤0.49;3+: 连接值>0.49。HER2:人表皮生长因子受体2,DIA:数字图像分析
  人表皮生长因子受体2免疫组化数字成像分析值与人表皮生长因子受体2荧光原位杂交拷贝数/比值的相关性
  接下来,对442例患者的FISH结果运用Pearson相关系数,分析HER2 IHC DIA连接值与HER2 FISH拷贝数和比率之间的相关性。HER2 IHC DIA连接值与HER2 FISH拷贝数的Pearson相关系数(r)为0.860594 (n = 442;P < 0.0001),平均决定系数(R2)为0.7245[图2]。HER2 IHC DIA连接值与HER2 FISH拷贝数的Pearson相关系数(r)为0.824927 (n = 442;P < 0.0001),平均决定系数(R2)为0.6701(图3)。根据反向转换平均Fisher 's z程序的cocor分析,这两个相关系数(DIA/拷贝数vs.DIA/比值)之间的差异为0.0357,,具有统计学意义(z = 3.8429,P = 0.0001)。根据2018年ASCO/CAP HER2指南对所有442例病例的FISH结果进行重新解释,分为5组,第1组和第3组为阳性,第2组,4组和5组为阴性。总体来看,仅有5例(0.8%)HER2 IHC DIA与HER2 FISH结果不一致,其中3例IHC DIA阴性,但FISH阳性,2例IHC DIA阳性,但FISH阴性[表3]。5例患者的HER2拷贝数均在4-6之间,但是3例阳性(ISH 1组)患者的比值>2,2例阴性(ISH 4组)患者的比值<2[表4]。其中4例病理学家评分为2+,1例病理学家评分为1+。使用或不使用替代探针(D17S122)进行额外的FISH检测,结果见表4。
  图2:人表皮生长因子受体2免疫组化数字成像分析的连接与人表皮生长因子受体2荧光原位杂交拷贝数的相关性。人表皮生长因子受体2免疫组化数字成像分析连接和人表皮生长因子受体2荧光原位杂交拷贝数的Pearson相关系数(r)为0.860594(n=442;P<0.0001)。(y=20.498x +1.7076R2=0.7245)
  图3:人表皮生长因子受体2免疫组化数字成像分析的连接与人表皮生长因子受体2荧光原位杂交比值的相关性。人表皮生长因子受体2免疫组化数字成像分析连接与人表皮生长因子受体2荧光原位杂交的Pearson相关系数(r)为0.824927(n=442;P<0.0001)。(y=7.1342x+0.7798R2=0.6701)
  根据ASCO/CAP HER2指南,HER2 FISH结果分为以下5组,1组:HER2/CEP17比值≥2.0,平均HER2拷贝数≥4.0信号/细胞;2组HER2/CEP17比值≥2.0,平均HER2拷贝数<4.0信号/细胞;3组:HER2/CEP17比值<2.0,平均HER2拷贝数≥6.0信号/细胞;4组:HER2/CEP17比值<2.0,4.0≤平均HER2拷贝数<6.0信号/细胞;5组:HER2/CEP17比值<2,平均HER2拷贝数<4.0信号/细胞。HER2:人表皮生长因子受体2,FISH:荧光原位杂交,ASCO:美国临床肿瘤学会,CAP:美国病理学家协会
  HER2:人表皮生长因子受体2,FISH:荧光原位杂交,DIA:数字图像分析,IHC:免疫组化
  人表皮生长因子受体2免疫组化数字成像分析的缺陷
  在使用DIA分析HER2 IHC的过程中,我们发现了几个缺陷和挑战。导致DIA假阳性的原因包括气泡、染料、导管原位癌(DCIS)成分和油墨[图4a-d]。另一方面,聚焦不准确或罕见的肿瘤细胞导致DIA假阴性结果[图4e和f]。
  图4:人表皮生长因子受体2免疫组化数字成像分析的缺陷。(a).气泡(红色箭头);(b)染料(红色箭头);(c)导管原位癌成分(红色箭头); 黑色箭头表示浸润性癌;(d)油墨(红色箭头);(e)聚焦不准确;(f)罕见肿瘤细胞(红色箭头)。绿色线标记人表皮生长因子受体2连接
  讨论
  据我们所知,包括612例浸润性乳腺癌在内的这项研究是使用整张切片图像验证HER2 IHC DIA最大的研究之一。我们的数据表明,基于HER2膜连接,HER2 IHC DIA是测定HER2蛋白表达的一种可靠方法。HER2 DIA不仅与病理学家的人工评分具有良好的一致性(87.3%),而且也降低了HER2 IHC不确定的病例数(减少16%)。所有不一致的病例(n=78, 12.7%)仅显示一步不一致(从阴性到不确定/从不确定到阳性,或者反之亦然)。我们的结果与之前的研究结果相符,在乳腺癌标本中,HER2 DIA和人工评分之间的一致率高达87.5%-94.2%。
  我们的数据还显示,HER2 IHC DIA可以准确区分基于2018 ASCO/CAP HER2指南解释为HER2 FISH阳性和阴性的病例。总的来说,只有5例(0.8%)的HER2 IHC DIA与HER2 FISH结果不一致,其中3例IHC DIA阴性,但FISH阳性(假阴性),2例IHC DIA阳性,但FISH阴性(假阳性)。之前的研究也发现可变频率的假阴性和/或假阳性病例。这5个病例的HER2拷贝数都在4-6之间,病理学家评分为2+(1例1+的除外),表示这些是临界的HER2基因扩增/蛋白过表达并且缺乏相关的临床结果信息的疑难病例。
  由于本研究使用的HER2 DIA也为每个病例呈现了从0到1的HER2连接绝对值,所以我们研究了其与HER2 FISH拷贝数和比率之间的相关性。分析显示,HER2 IHC连接值与HER2拷贝数的相关性优于HER2/CEP17比值(r:0.860594 vs. 0.824927),提示HER2拷贝数可能更准确地预测HER2蛋白表达,甚至抗HER2靶向治疗的反应也可能优于HER2/CEP17比值。这与先前的文献结果一致,即比值≥2且拷贝数<4的乳腺癌主要是HER2 IHC阴性,且与拷贝数为u4的乳腺癌相比,对HER2靶向治疗的反应较慢。
  最后,我们确定HER2 DIA过程中的几个缺陷,包括气泡、染料、DCIS成分和油墨,这些缺陷会导致假阳性结果以及由聚焦不准确和罕见肿瘤细胞导致的假阴性结果。这些缺陷并不少见(4%,25/612),但大多数都可以通过重新处理玻片(气泡)、重新扫描(聚焦不准确)和仔细标注感兴趣的区域(染料、DCIS成分和油墨除外)避免。
  总结
  综上所述,我们已经证明,HER2 IHC DIA是与病理学家人工评分和HER2 FISH具有较高一致性的,可用于判断乳腺癌HER2状态的一种可行、有效的工具。我们的数据也揭示,HER2 IHC连接与HER2拷贝数的相关性优于HER2/CEP17比值,表明HER2拷贝数对预测HER2蛋白表达,甚至抗HER2靶向治疗的反应可能更加重要。此外,HER2 IHC DIA以连续的定量值测定HER2蛋白,提供与临床结果相关的实用信息。
责任编辑: 夢奕新
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