生物标志物之肌红蛋白(MB)

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  肌红蛋白(myoglobin,MB)存在于哺乳动物Ⅰ型、Ⅱa型骨骼肌和心肌组织细胞质中,是一种重要的细胞内色素蛋白。MB(Mr17600)包含由153个氨基酸残基组成一条多肽链和一个辅基血红素。肌红蛋白功能研究起始于millikan对肌红蛋白功能的假设。他认为在机体中,MB能够促进组织内的氧供给,具有氧转运载体、细胞内催化剂和氧储存等功能。转基因动物为MB的生理功能研究提供了适当的动物模型。通过采用基因敲除技术,garry等建立了MBKO小鼠模型,研究人员发现MBKO小鼠不仅能够繁殖,而且可以在低氧环境下保持正常的运动能力,研究人员对MB的生理意义提出了质疑。这个研究结果似乎表明,对于哺乳动物MB并非我们想象的那么重要。在Garry研究工作基础上,后来的一些研究小组对MBKO小鼠的心脏功能、生理代偿机制、缺氧环境下运动耐受性和心脏功能、基因组学、蛋白组学等进行了更为深入的研究。虽然一些研究所展示出的MB的生理功能,尚未得到研究者的广泛接受,但是这些研究都揭示出作为心肌和骨骼肌中的重要组成蛋白和氧化还原功能蛋白,MB在参与心肌和骨骼肌细胞的氧供给和氧消耗中发挥重要作用。
  1、氧储存功能研究
  1.1氧储存功能
  MB作为肌肉中的重要组成性蛋白,其氧储存功能已经被广泛接受。特别是在水生哺乳动物和鸟类肌肉中,MB能够在长期呼吸暂停中为肌肉收缩提供氧气。当潜水时,动物无法依靠呼吸来满足对氧气的需求,这时MB储存的氧气能够解离出来,维持肌肉收缩对氧的需求。相比那些没有长时间呼吸暂停的动物,水生哺乳动物和鸟类肌肉组织中MB的浓度要高得多;MB在肌肉中的浓度对这些动物的潜水时间具有显著和决定性的作用。人类和陆生哺乳动物肌肉中的MB浓度与其居住的海拔相关,高海拔地区哺乳动物心肌和骨骼肌中的MB含量也更高。在不同类型的肌肉组织中,氧耗较高的肌肉中MB浓度也相应较高,在长期持续收缩的肌肉中特别是心肌中MB浓度最高。这些都证明了MB的氧储存功能。
  1.2氧储存能力
  1个MB分子可以结合1个O2,因此MB的氧储存能力与其在肌细胞中的浓度以及MB的氧饱和程度成正比关系。通过对小鼠心脏再灌注过程的研究发现,MBKO小鼠心脏发生无流缺血时,心脏功能显著降低;而当使用CO抑制WT小鼠心肌MB功能时,MBKO和WT小鼠心脏功能降低基本一致。这说明在短暂缺血过程中,MBO2可以作为氧储存体为心肌提供氧气。通过测量小鼠心肌中的MB浓度,根据心肌氧化磷酸化的速度,经过计算得出,在心肌缺血过程中,MB储存的氧可供给心肌进行氧化磷酸化的时间为2.8s。小鼠心肌缺血试验中也观察到,WT小鼠心脏功能比MBKO小鼠的心脏功能降低延迟2s。这说明MB在肌肉组织中具有氧储存的功能,而且MB所储存的氧气量非常有限,仅仅能够短暂地为肌肉收缩提供氧气。
生物标志物之肌红蛋白(MB)
  2、氧转运载体及促进氧扩散功能
  2.1氧转运载体
  在体外的溶液中,MB存在能够加快氧在溶液中扩散速度。相对于自由氧在溶液中极低的溶解度,MB对O2的高亲和性赋予了MB作为氧转运载体的能力,并在促进氧转运中发挥作用。通过对陆生和陆生鸟类以及哺乳动物的MB的氧亲和力进行测定,研究人员发现,相比于陆生鸟类和哺乳动物,那些需要长时间潜水的动物其MB的表现出氧亲和力更高的趋势。一些研究人员通过模拟计算的方法,绘制出了氧气与MB结合及其内部迁移的3D图像。
  2.2促进细胞内氧扩散
  研究人员对MB是否能够促进细胞内氧的扩散一直存在争议。在对MBKO小鼠的研究中研究人员发现,MBKO小鼠不仅能够繁殖,甚至MBKO小鼠的心脏、肌肉能够在缺氧条件下保持正常的功能。因此他们提出假设,MB并非陆生动物妊娠和运动能量代谢所必需的,并对MB促进的细胞内氧扩散的生理意义提出了疑问。
  为了研究MB在细胞内促进氧转运过程中的作用,Marc等使用CO急性抑制MB同氧气的结合,MB完全氧合时(MBO2100%),MBKO小鼠心脏功能同WT小鼠没有区别;MBO2部分去氧合时(MBO287%),WT小鼠心脏氧耗(VO2)和心肌收缩力(LVDP)显著降低,而MBKO小鼠VO2、心肌收缩力保持不变。试验结果表明:MB氧合程度不同对MBKO、WT小鼠心肌组织功能影响也不同。当动脉氧含量为65%(MBO287%)时,MB促进细胞内氧转运。
  在运动负荷下,同WT小鼠相比,MBKO小鼠离体心脏在心肌收缩力、心率、静息状态下氧耗和运动耐久能力等方面明显降低。超声心动图显像表明,MBKO小鼠心脏输出量和心脏收缩力也明显降低,而且对β1兴奋剂失去反应。
  Ping-Chang等采用脉冲场梯度核磁共振技术测量了离体灌注大鼠心脏中MB的平动扩散系数(DMB),并对MB扩散方向以及DMB的温度依赖进行了研究。在温度22℃~40℃,DMB(4.24~8.37)×10-7cm2/s,而且MB的扩散没有表现出各项异性。当大鼠心肌中MB平衡扩散氧分压PO2降低到1.77mmHg或骨骼肌中PO2(氧分压)降低到5.27mmHg时,MB促进细胞内氧转运与自由氧的供给相等。由于MB浓度对平衡扩散氧分压的影响,在海洋哺乳动物肌肉中,当PO2降低到67mmHg时,MB促进的氧转运同自由氧的供给相等。对于陆生哺乳动物来说,当能量消耗增加、细胞内PO2显著降低时,MB促进的氧转运对于氧流的贡献才具有生理学意义。
  研究者还观察到MBKO小鼠心肌中有17个显著差异表达基因。不同实验组,缺氧诱导因子1-α未发现差异。WT/MBKO小鼠心脏脂肪酸结合蛋白、热休克蛋白27表达下调。研究MBKO小鼠胚胎发育过程中,研究者观察到MBKO小鼠胚胎干细胞和成活的MKBO小鼠心室中,缺氧诱导因子1、缺氧诱导因子2、热休克蛋白、VEGF基因的转录显著增加,与WT小鼠相比差异具有统计学意义。
  MBKO小鼠能够繁殖,甚至在缺氧条件下,MBKO小鼠的心脏、肌肉能够保持正常的功能,这是通过一系列复杂的代偿机制实现的。相比于WT小鼠,MBKO小鼠冠状动脉流和冠状动脉容量显著增加,MBKO小鼠心脏中毛细血管密度显著增加MBKO,血细胞比容(红细胞压积)均显著提高(44%、48%~72%)。MBKO小鼠在表型上没有显著的功能缺陷,其心肌表现出多种复杂的代偿机制。这些代偿机制能够弥补MB缺失导致的功能缺失。表面上看起来,MB促进的细胞内氧转运并非生理条件下不可缺少的,MBKO小鼠够存活并且繁殖,甚至在缺氧条件下,MBKO小鼠的心脏、肌肉也保持正常的功能。对于MBKO表现出的代偿机制究竟反映出MB在生理状态下的意义,学者们也有不同的见解。然而,通过提高心肌毛细血管密度、增加血流量、缩短毛细血管到线粒体氧气扩散的距离,提高氧分压梯度,基因转录以及蛋白表达水平的改变等代偿途径虽然可以弥补MB缺失造成的功能缺失,但是这也恰好说明,MB对于细胞内氧转运是十分重要的。
  一些学者对根据MBKO小鼠代偿机制而推断MB促进细胞内氧转运的观点并不认同。他们认为代偿机制并不足以说明MB促进的氧转运是生理条件下所必须的。因为无法清楚地辨明MBKO小鼠在发育过程中产生的代偿机制究竟是由于MB氧储存功能缺失导致的亦或是由于MB促进氧转运而导致的。在MBKO动物心脏中,心脏的高血流量和增加的毛细血管密度使组织中的PO2升高,进而导致了细胞内溶解氧的增加。多余的氧储存足够保证心脏收缩过程中有充足的氧气供给。在节律性收缩的肌肉组织中,CO不仅抑制了MB促进的氧转运,同时也降低了MB的氧储存功能(氧储存的减少也可能引起肌肉功能降低),采用CO抑制MB氧合的同时无法排除CO对其他氧代谢相关蛋白的影响。因此,他们认为没有证据表明MB促进氧转运具有显著的生理学意义。通过采用实验研究的方法很难辨别MB在氧转运和氧存储功能上的区别,一些研究结果仍然存在分歧、甚至相悖。虽然,学者对MB在生理状态下发挥氧转运功能仍然存在争论;但是当细胞内氧分压显著降低,MBO2部分去氧合时,MB能够促进细胞内氧转运的结论是肯定的。
  3、NO的调节功能
  2001年,Ulrich等首次报道了MB在心肌中可能具有清除NO的功能。通过对离体小鼠心脏中MBO2向甲基化肌红蛋白(metMB)的转化发现,使用不同浓度NO(5nmol/L至25μmol/L)溶液直接灌注离体小鼠心脏,或使用不同剂量的缓激肽(BK;10nmol/L至2μmol/L)刺激离体小鼠产生内源性NO,当NO浓度大于2.5μmol/L或者BK大于1.0μmol/L时,WT小鼠心脏中metMB形成的增加同NO浓度或BK浓度存在剂量效应关系。而且metMB的形成是可逆的,在去除NO后,metMB迅速恢复为MB。相比WT小鼠,MBKO小鼠对NO的血管舒张和心脏镇静作用更加敏感。WT小鼠对NO的低敏感性,可能是由于MB的存在导致NO向NO3-的降解,从而有效降低细胞内NO的浓度造成的。据此,他们描绘出MB在细胞内清除NO的可能途径。在研究慢性缺氧条件下MBKO小鼠心肌功能过程中,研究人员发现,缺氧环境造成的小鼠心肌功能损伤是可逆的,而使用NO合酶抑制剂能够抑制损伤的发生。实验表明,缺氧环境下的MBKO小鼠心脏功能障碍是由NO介导的,从而间接证明MB具有细胞内NO水平的调控作用。近期的研究表明,MB作为亚硝酸盐还原酶,在调节细胞内NO水平和线粒体的呼吸作用中发挥极为重要的作用。
  4、抗氧化功能
  由于MB在细胞内氧供给和氧消耗中的重要作用,一些研究人员提出MB在能够降低自由基对心肌的毒性的假设。他们使用H2O2或其他超氧化物对离体MBKO/WT小鼠进行心脏灌注,当H2O2浓度达到10Μmol/L以上,MBKO小鼠左心室舒张压显著降低。小鼠心脏缺血后再灌注试验结果表明,MBKO小鼠心脏缺血后的功能恢复较WT对照组延迟。通过增强化学发光技术测量小鼠心肌内活性氧自由基的释放,MBKO小鼠心肌内活性氧自由基远高于WT对照组。MB的缺乏不仅增加了心肌功能受损,而且使内源性或者外源性氧化损伤风险提高。研究结果提示,在心肌物质代谢过程中,MB可能是影响氧化还原反应以及保护心脏免受氧化性损伤的一个重要因素。
  受到现阶段技术限制,研究者仍然无法全面了解MBKO小鼠的基因组变化;相对于细胞内20万种以上的蛋白,双向电泳技术也仅仅可以检测600~800种蛋白,一些细胞内低丰度表达的蛋白(如转录因子)无法被检测到。由于研究者使用不同遗传背景的MBKO小鼠,加上试验方法的差异,关于MB功能的一些研究结果仍然存在分歧、甚至相悖。但是MBKO动物的代偿机制已经向我们展示出MB在细胞内氧储存、转运,细胞色素氧化酶活性,内源性氮氧化物、自由基的清除,脂肪酸代谢等生理过程中具有十分重要的意义。随着新技术的发展,作为哺乳动物心肌和骨骼肌中重要的组成蛋白和功能蛋白,MB的功能研究也将更为深入。
责任编辑: zh025
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