应建明教授:一文读懂肿瘤突变负荷

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  编者按  近年来,免疫检查点抑制剂使晚期癌症的治疗发生了革命性的变化。这些药物包括靶向CTLA-4或PD-1/PD-L1的抗体,然而,仅有少部分病人能够获益。因此,临床需要寻找预测生物标记物以确定免疫治疗的优势人群。目前的研究结果提示PD-L1免疫组化、T细胞浸润水平、T细胞受体克隆性、基因表达信号和外周血标记物与临床治疗疗效密切相关。最近研究发现较高的肿瘤突变负荷(tumor mutational burden, TMB)与多种癌症类型免疫治疗后的较长的总体生存期有关,提示TMB可以作为一种免疫检查点抑制剂治疗疗效的预测生物标记物。然而,对于高TMB还缺乏一个广泛的定义。91360特邀医科院肿瘤医院应建明教授就TMB相关知识、检测方法、目前存在的问题以及解决方案进行介绍,以便大家更好地了解TMB。
应建明
主任医师,教授,博士生导师
国家癌症中心中国医学科学院肿瘤医病理科副主任
中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会副主任委员/青委会主任委员
中华医学会病理学分会青委会副主任委员
中国医师协会分子病理委员会副主任委员
中华医学会病理学分会分子病理学秘书长
中国研究型医院学会病理学委员会副主任委员/青委会主任委员
中国研究型医院学会超微与分子病理副主任委员
  TMB的定义及与新抗原的关系
  肿瘤突变负荷(Tumor Mutation Burden,TMB)定义为一份肿瘤样本中,所评估基因的外显子编码区每兆碱基中发生置换和插入/缺失突变的总数。
  一般来说,癌症基因组内的体细胞突变是一个多因素过程,这些因素可能为内源性和外源性,前者包括DNA修复基因或参与DNA复制基因的缺陷或改变如聚合酶ε(POLE),后者如吸烟或紫外线暴露。体细胞高度突变可能导致突变基因编码的蛋白修饰,这种修饰的蛋白被免疫系统识别为“非自我“,随后作为肿瘤特异性新抗原激活特异性抗肿瘤免疫反应。
  新抗原的产生不一定与更高比例的体细胞突变有关,但后者可能增加发生新抗原的可能性。因此,具有高度非同义TMB的肿瘤表达大量异常蛋白,这些异常蛋白被免疫系统识别为新抗原。因而,TMB高提示产生的新抗原多,应用免疫检查点抑制剂释放的T细胞更有可能识别新抗原,从而达到攻击和杀死肿瘤的作用,因此肿瘤组织中TMB检测可能有助于预测免疫检查点抑制剂的疗效。
  但是值得注意的是,并不是所有位于细胞表面的肿瘤性抗原具有免疫源性,肿瘤突变负荷因肿瘤类型以及不同病人而不同。
  TMB在肿瘤中的分布
  虽然TMB可以预测免疫检查点治疗的疗效以及预后,但各肿瘤类型间TMB水平差异很大,并不是所有的肿瘤都具有高TMB。在过去的几年中,许多研究已经能够描绘和描述TMB在各种疾病中的变化。根据这些研究结果发现不同肿瘤类型中TMB不一致,如TMB在黑色素瘤中最高,其次是NSCLC和其他鳞状细胞癌,而白血病和儿童肿瘤TMB水平低,乳腺、肾脏和卵巢癌中TMB水平处于中间状态。
  TMB水平除了在不同肿瘤类型中不一致外,在同一癌症类型不同个体中也可有明显差异。在NSCLC中,具有驱动型基因突变(如EGFR、ALK和ROS1基因改变)的肺癌患者TMB明显减低,但KRAS或BRAF改变不影响TMB状态。另外,患者吸烟情况也可影响NSCLC的TMB水平。
  在肿瘤进化的后期,某些细胞发生了突变,而另一些细胞则没有发生突变(所谓的亚克隆突变),这样也会影响同一肿瘤中不同细胞亚群TMB的水平,即肿瘤内异质性。考虑到肿瘤内异质性可能在不同肿瘤类型中有变化,并潜在影响抗肿瘤免疫性,在分析TMB时需要考虑到肿瘤内异质性。
  TMB的检测方法
  目前检测TMB的方法主要为基于二代测序技术(NGS)的全外显子测序(WES)和大panel测序。
  由于癌症进展过程中可能累积的大量变异,这些突变可能导致新抗原产生,而WES检测存在于整个外显子中的体细胞突变,可以提供有可能在肿瘤进展中起作用的突变的全貌,因此TMB理论上最好由WES检测。TMB通常报告为编码和体细胞突变的总数,但在某些情况下,也可能包括插入和缺失(Indels)。
  然而,由于WES成本高以及操作繁琐,至少需要150-250ng基因组DNA,如果活检组织太小或没有足够的肿瘤细胞就难以得出准确的结果,另外还需要配对的正常DNA,因此由该技术检测的TMB很难作为预测肿瘤免疫治疗疗效的一种常规临床方法。
  基于NGS的靶向基因套餐(panel)被设计用于TMB检测,目前主要有FoundationOne CDx NGS和MSK-IMPACT NGS平台。FoundationOne CDx NGS平台将TMB定义为在靶向基因的编码区内碱基替换(包括同义突变)的数量,基因组DNA不需要测序,但需要使用公共和私人变异数据库进行致癌驱动事件和胚系状态的过滤。总突变/兆碱基(mut/Mb)的计算包括同义突变和非同义突变,这两种突变都需要一个转换公式才能转换为WES确定的错义突变数量。MSK-IMPACT NGS平台使用来自肿瘤和胚系DNA的测序数据对非同义突变进行比较。该平台的最新测序panel可以测序468个基因,覆盖1.22Mb。一些研究显示TMB的Panel检测与WES检测具有很好的一致性,可以有效地预测对免疫检查点抑制剂治疗的反应。3种TMB检测平台关键参数的比较见表1。
表1  3种TMB检测方法的关键参数
  TMB检测结果的影响因素
  影响TMB检测结果的因素较多,包括分析前、分析中和分析后因素。分析前因素如样本收集和处理,检测样本的质量和数量,固定方法和文库准备等可影响DNA的数量和质量,从而影响了TMB的数值,例如固定及固定时间可影响福尔马林固定石蜡包埋诱导的脱氨基假象,这样对TMB测量的分析产生影响。而且,样本中低肿瘤纯度可导致TMB检测敏感度降低。对于测序来说,不同检测平台所覆盖的基因组区域以及panel内包括的基因不同,覆盖的深度也不同,这些都可导致TMB检测结果不一致,从而影响TMB的准确性和敏感性。另外,生物信息学中的一些因素也可以影响TMB的检测结果,如胚系变异的除去/过滤、参考转录本来源、变异调用方、TMB评估内的变异计算、等位频率/分数以及最小变异计数等。表2总结了影响TMB评分的一些因素。
表2  TMB评分的影响因素
  TMB的cut-off值及其解决方案
  目前,围绕TMB开展的临床试验很多,但是不同的实验平台,不同的肿瘤类型以及不同的实验室对TMB的cut-off值定义不同,从而导致了检测报告不一致性。
  在已发表的研究中,TMB估算和报告方式的差异很大,这表明目前TMB的评估方法明显缺乏标准化和协同性。这些明显的差异可来自于理论框架、应用的技术方法、TMB报告的方式等。这就强烈需要对TMB检测方法和检测结果进行标准化,TMB评估方法的标准化将确保各检测平台和中心的TMB评估和报告的一致性,而协同性将使TMB评分在各检测平台和中心能够更加准确地比较,这需要认证机构、病理学家和肿瘤学家共同努力来解决这一问题。
  最近,Friends of Cancer Research (Friends) 和Quality Assurance Initiative Pathology (QuIP) 组织合作和协调努力来解决临床样本中TMB评估和报告标准化和协同性问题。为了获得不同检测方法、平台和中心之间临床样本中TMB评估和报告的一致性,这2个国际组织提出了一些建议,具体建议见表3.
表3  持续性TMB评估的建议
  TMB的临床研究
  在少数采用CTLA-4阻断剂治疗的黑色素瘤病人、PD-1/PD-L1抑制剂治疗的非小细胞肺癌患者、黑色素瘤和膀胱癌病人中观察到突变负荷高的人群临床受益更多。最近的研究发现较高的肿瘤突变负荷与多种癌症类型免疫治疗后的疗效有关,提示TMB可以作为一种免疫检查点抑制剂治疗疗效的预测生物标记物。
  CheckMate-032的临床试验对非小细胞癌(NSCLC)患者分析发现高TMB组相对于中、低TMB组对免疫检查点抑制剂的ORR明显增高,而且高TMB患者接受双药联合治疗的1年生存期明显高于中、低TMB组。
  此外,研究者分析了9887例各种类型癌症的临床样本中PD-L1表达和TMB,结果显示PD-L1和TMB可以独立的预测免疫检查点抑制剂的治疗效果。
  另外,许多研究显示较高TMB与许多肿瘤类型包括NSCLC、结直肠癌、膀胱癌、黑色素瘤的预后有关。但是也有相关报道tTMB在免疫联合化疗一线治疗转移性非鳞状NSCLC中的临床效用可能有限。
  在今年ESMO公布的几个针对NSCLC的临床研究中回顾性分析TMB与疗效的关系发现,TMB与免疫联合化疗对比化疗的PFS有预测作用,OS没有明显差异(KEYNOTE-189 & KEYNOTE-407)。但是,TMB与免疫单药对比化疗的ORR、PFS、OS 有预测作用(KEYNOTE-010 & KEYNOTE-042)。
  关于TMB作为免疫治疗相关生物标志物仍需要更多的数据,免疫单药和双免疫联合治疗的PD-L1表达阴性非鳞癌患者中,TMB可能起到一定作用。
  总结
  TMB作为一种潜在可预测免疫检查点抑制剂治疗疗效的生物标记物,越来越多地被应用于临床实践和临床试验中。对于TMB检测,虽然WES被认为是检测的金标准,但由于各种原因,很难应用于临床实践中,目前推荐采用大panel检测方法。值得注意的是,影响TMB检测结果的因素较多,因此,认识这些因素并积极采取措施是提高TMB检测结果准确的重要手段。
  由于TMB检测目前尚未有标准化方法,导致检测结果也没有标准化,因此,建立一个统一的TMB检测平台和报告体系对于临床医师的治疗决定至关重要。相信随着TMB在临床研究及实践中的广泛应用,TMB检测中的一些问题必将得到很好地解决,从而能够更好地指导临床治疗。
NP/IO/4296/10/25/19-10/25/20
责任编辑: 奶糖
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