伴“低级别浆液”样成分的混合型子宫内膜癌:临床病理、免疫组化和分子遗传学研究

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  摘要 最近,我们报道了2例伴“低级别浆液”样成分混合型子宫内膜癌,它们不符合癌症基因图谱描述的4种分子组中的任何一种。为了了解这些肿瘤的本质,我们对这2个病例进行了免疫组化和分子遗传学研究,并增加了第3例。我们检测了p53、ER、Ki67、WT1、MLH1、PMS2、MSH2和MSH6的免疫表达。我们也进行了针对体细胞突变包括常参与癌症发生的基因如TP53、KRAS、PIK3CA的靶向二代测序,也进行了PTEN和POLE的Sanger测序。所有患者均未生育并有病态肥胖。她们的肿瘤显示微乳头成分,类似于卵巢低级别浆液性癌,并与绒毛腺性子宫内膜样癌混杂在一起。浸润性肿瘤腺体呈微囊、拉长或碎片状模式和含有砂粒体。2例肿瘤表达异常p53,所有3例都表达ER。所有3例显示KRAS突变,2例有TP53突变。一例病人发展为腹膜癌病,一例病人带瘤生存,另一例病人死于脑肿瘤。第3例病人的肿瘤局限于子宫(IA期),该患者带瘤生存,但仅随访6个月。伴“低级别浆液”样成分的混合型子宫内膜癌显示子宫内膜样和浆液样分化的形态学谱并呈微囊、拉长或碎片状特征,该肿瘤呈ER阳性表达,KRAS 和TP53基因突变和具有侵袭性行为。
  前言
  子宫内膜癌是西方国家女性生殖道中最常见的恶性肿瘤。在过去的30年,根据临床、代谢和内分泌特点,它被分为2种主要类型:I型或子宫内膜样癌(约占80%)主要发生于绝经前或围绝经期,与雌激素过剩、肥胖及子宫内膜增生有关。I型癌是高分化癌,通常局限于子宫,预后好。相反,Ⅱ型肿瘤(约占10%)是非子宫内膜样(主要是浆液性和透明细胞)癌,与雌激素刺激无关,发生于萎缩的子宫内膜,有时在子宫内膜息肉内,预后差。参与子宫内膜样癌发展的分子遗传学改变不同于那些非子宫内膜样癌(Ⅱ型)。虽然子宫内膜样癌与PTEN、KRAS、CTNNB1、PIK3CA突变及微卫星不稳定有关,但浆液性癌存在TP53突变、p16和E-cadherin失活、c-erbB2扩增,以及反映染色体不稳定的数个染色体的杂合性缺失。分子遗传改变的差异被认为与子宫内膜癌分成2型是一致的,因此提出了子宫内膜癌发生的二元模型。
  然而,子宫内膜癌仅分为2种类型后来被认为是武断的,二元模型受到了挑战。在日常实践中,病理学家经常见到具有子宫内膜样癌和浆液性癌复合或杂交形态及分子特征的子宫内膜癌。
  为了做出更精确的分类,肿瘤基因组图谱(TCGA)研究网使用基于阵列和测序的技术对373例子宫内膜癌(307例子宫内膜样癌、53例浆液性癌和13例混合型癌)进行了整合的基因组、转录子组和蛋白质组学分析,发现了4种不同的分子亚型:(1)具有POLE突变的子宫内膜样癌(超突变型),(2)微卫星不稳定型子宫内膜样癌(高突变型),(3)具有低突变拷贝数改变的子宫内膜样癌,(4)以浆液性为主的浆液样子宫内膜样癌伴高度拷贝数变异和常有TP53突变。一个重要的发现是,高级别子宫内膜样肿瘤聚类成或为超突变(POLE突变)或高拷贝数(TP53突变)亚型,而混合性子宫内膜癌分为低拷贝数(子宫内膜样)癌和高拷贝数(浆液样)肿瘤  ,反映了这些肿瘤的分子遗传学异质性。
  最近,我们报道了2例伴有类似于卵巢低级别浆液性癌的混合子宫内膜癌,它们不符合4种TCGA分子组中的任何一组。本文我们应用二代测序研究了3例显示低级别子宫内膜样成分和第2种成分类似于卵巢低级别浆液性癌的混合性子宫内膜癌的临床病理、免疫组化和分子遗传学特征。其中2例以前作为一系列混合性和不明确的子宫内膜癌的一部分而进行了报道。理解这些肿瘤的性质不仅对预后有重要意义,而且对识别能够改善这些患者临床治疗的生物标志物也很重要。
  2  材料与方法
  2.1  组织样本
  这项研究包括了来自西班牙巴塞罗那圣·保罗医院病理档案中的3例显示低级别子宫内膜样成分和类似于卵巢低级别浆液性癌的第二种成分的混合子宫内膜癌。所有3例肿瘤最初在子宫内膜活检,随后是子宫切除标本中进行诊断。肿瘤按照2014年WHO分类推荐的组织病理学标准进行分类,并采用国际妇产科联合会(FIGO)2009年提出的分期分类进行独立分期。所有患者都有随访信息。2例之前被报道过。病例都是匿名的,研究得到了伦理委员会机构的批准。
  2.2  免疫组化分析
  免疫组织化学使用标准的半自动平台进行。所使用的抗体与评分截断值的描述见表1。评分由2名病理医生(I.E.和R.D.)独立完成。当意见不同时,在多头显微镜下取得共识。如果大于80%的肿瘤细胞呈弥漫性中等至强的一致p53核染色(弥漫性),或在间质细胞局灶性p53核染色情况下,肿瘤细胞核完全缺失p53表达(完全缺失),则p53染色被认为是异常(突变/失活)。如果肿瘤细胞存在任何程度的非弥漫性p53核染色(<80%),p53免疫染色则被认为是正常(野生型模式)。
表1 抗体和评分标准
伴“低级别浆液”样成分的混合型子宫内膜癌:临床病理、免疫组化和分子遗传学研究
  2.3  DNA提取
  对福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤蜡块的质量和肿瘤含量进行评估,每个病例选出一个代表性的蜡块,包含至少70%的肿瘤细胞。在2个病例(病例1和3)中,从2种组织学成分中提取DNA。根据产品说明书利用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒(Qiagen, Hilden,Germany)提取基因组DNA。
  2.4  二代测序
  2.4.1. NGS测序的文库和模板准备
  该检测需要FFPE标本中的20ng基因组DNA。然后通过建立2个多聚合酶链反应(PCRs)而对每个样本准备文库,DNA的2个引物池的每一个来自于Illumina Trusight肿瘤15(Illumina,San Diego,CA,USA)。热循环根据说明书进行。12pmol/L的 DNA文库池被用于Miseq系统(Illumina,San Diego,CA,USA)的模板。
  2.4.2 生物信息学和数据分析
  测序数据分析采用Illumina转换工作室数据分析软件2.2.3版本进行。此工作流程可以报告单核苷酸变异及处理低至5%的变异等位基因片段。
  2.5  PTEN和POLE突变分析
  通过对肿瘤DNA的PCR扩增和随后的测序分析,对PTEN和POLE外切酶基因突变进行了鉴定。用以前报道的PCR条件和引物对PTEN的外显子4-8和POLE的外显子9-14进行突变分析。热循环条件是, 94°C,12min,94°C,45 sec,4循环,特异的55°C退火引物温度,45 sec,72°C 10min,最后72°C 10 min延伸。每个样品都在ABI 3500基因分析仪(Applied Biosystems,Foster City,CA)上进行毛细管电泳。
  3  结果
  3.1  临床病理特征
  表2总结了3例显示“低级别浆液”样成分的混合子宫内膜癌的临床病理特征。患者平均年龄为58.6岁(范围在38-78岁)。所有患者均未生育,存在病态肥胖,并出现异常子宫出血。诊断是在子宫内膜活检及随后的经腹全子宫切除术及双侧输卵管卵巢切除术中进行。肿瘤的子宫内膜起源是由临床病史和病理结果决定的。1例病人(病例1)接受了新辅助疗法和辅助性化疗(卡铂和紫杉醇),另1例病人(病例2)接受辅助性短距离放疗。第3例病人没有接受辅助性治疗。
表2 3例伴“低级别浆液”样成分的子宫内膜样癌的临床病理特征
伴“低级别浆液”样成分的混合型子宫内膜癌:临床病理、免疫组化和分子遗传学研究
  缩写:AWD,带瘤生存;LGSL,低级别浆液样成分;NED,无疾病证据;SC,浆液性癌;TAH-BSO,经腹子宫切除术和双侧输卵管卵巢切除术。
  a患者接受新辅助治疗和辅助化疗(卡铂和紫杉醇)。
  b患者死于脑瘤,未进行活检,转移无法证实。
  3.2  随访
  所有患者均有随访信息。一个肿瘤(病例1)发生腹膜癌病,并扩散到盆腔外(Ⅳ期),也有双侧附件转移和盆腔淋巴结转移,双侧附件转移灶表浅和小。另外两个肿瘤(病例2和3)局限于子宫,其中1例(病例2)侵犯子宫肌壁50%以上(IB期),另1例(病例3)侵入肌层小于50%。1例病人(病例1)在术后4年带腹膜播散生存。第2例病人(病例2)在1.5年后死于脑肿瘤,该肿瘤未进行活检,因此无法证实是否转移而来。第3例病人在术后半年内没有无病生存。
  3.3  病理结果
  所有3例肿瘤显示了不同成分之间的直接接触。子宫内膜样成分主要表现为腺性或绒毛腺性特征,且为低级别(FIGO分级1级)(图1A、2A、B和3C)。在任一病例中都没有发现明确的鳞状细胞分化。在1个病例(病例3)中有一个伴实性-筛状结构的高级别子宫内膜样癌区域(图3F)。非子宫内膜样成分表现出少见的组织学特征。有纤细的乳头状成分,类似于卵巢低级别浆液性癌(图1A和B,2A和C,3A和B,以及3D)。分枝的微乳头显示透明变性的轴心,衬覆1或2层具有少量胞质和小到中等大小细胞核的上皮细胞。肿瘤细胞有明显出芽。微乳头成分与呈绒毛腺性特征的子宫内膜样成分混合而几乎看不出来(图1A、2A和B)。核分裂像低。在所有3例肿瘤中,侵袭性腺体表现出微囊、拉长或碎片状(MELF)模式,并伴有砂粒体(图1D、2D和3D)。在1例肿瘤(病例1)中,网膜、卵巢和淋巴结转移类似于浆液性交界性肿瘤相关的侵袭性种植(图1D)。转移性肿瘤显示微钙化灶和砂粒体(图1D)。在病例3中,在子宫内膜活检中只发现少量浆液性癌(图3E)。所有病例输卵管粘膜均正常。
伴“低级别浆液”样成分的混合型子宫内膜癌:临床病理、免疫组化和分子遗传学研究
  图1 混合性子宫内膜癌(病例1)伴微乳头成分类似于卵巢低级别浆液性癌(A和B);伴MELF的肌层浸润(C)和浅表卵巢转移(D). D,转移性肿瘤显示微钙化和砂粒体。
伴“低级别浆液”样成分的混合型子宫内膜癌:临床病理、免疫组化和分子遗传学研究
  图2 混合性子宫内膜癌(病例2)伴显示分枝微乳头的“低级别浆液”样成分(A,B,C)和MELF型肌层浸润(D)。
伴“低级别浆液”样成分的混合型子宫内膜癌:临床病理、免疫组化和分子遗传学研究
  图3 混合性子宫内膜癌(病例3)伴微乳头“低级别浆液”样成分(A,B,D);子宫内膜样成分主要表现为腺性或绒毛腺性特征(C)和伴MELF和砂砾体的肌层浸润(D)。肿瘤显示小灶的浆液癌(E)和高级别子宫内膜样癌(F)。
  3.4  免疫组织化学
  我们进行了p53、ER、Ki67、WT1、MLH1、PMS2、MSH2和MSH6的免疫组化染色(表3)。2例肿瘤显示异常p53表达;1例(病例3)有p53过表达,另1例(病例2)完全没有p53核染色。所有病例ER均为阳性,2例肿瘤()病例1和3)Ki67指数高(图4)。所有病例WT1均为阴性。DNA错配修复蛋白(MLH1、PMS2、MSH2和MSH6)在所有病例中的表达都是完整的。
表3 3例混合性伴“低级别浆液”样成分的子宫内膜样癌的免疫组化结果
伴“低级别浆液”样成分的混合型子宫内膜癌:临床病理、免疫组化和分子遗传学研究
  缩写:WT,野生型。
  a所有成分中p53核染色完全缺失。
  b在各组分中的过度表达。
伴“低级别浆液”样成分的混合型子宫内膜癌:临床病理、免疫组化和分子遗传学研究
  图4 免疫组化结果。病例1:(A)正常p53,(C)阳性ER,(E)高(60%)Ki67。病例3:(B)异常p53,(D)阳性ER,(F)高(30%)Ki67。
  3.5  分子遗传学研究结果
  通过二代测序,所有肿瘤都显示有KRAS突变(病例1:pGly12Asp;病例2:p.Gly13Asp;病例3: p.Gln61His)(表4)。2例有TP53突变(病例2:p.Thr125Met,p.Thr170Met和p.Val157lle;病例3:p.Arg248Gln)。1例有PIK3CA突变(病例3:p.Gln61His)。在病例2中也检测到其他基因突变:EGFR(p.Gly721Ser)、ERBB2(p.Arg784Cys)、GNA11(p.Glu221Ter)和KIT(p.Arg830Ter)。通过Sanger检测,所有病例均无PTEN和POLE的外切酶位点突变。
表4 3例伴“低级别浆液”样成分的混合性子宫内膜样癌的分子遗传学结果
伴“低级别浆液”样成分的混合型子宫内膜癌:临床病理、免疫组化和分子遗传学研究
  3  讨论
  最近我们报道了2例伴有低级别浆液样成分的混合性子宫内膜样癌,它们不符合TCGA分子分组中的任何一种。为了更好地理解这些肿瘤的本质,我们使用了二代测序进行了临床病理、免疫组化和分子遗传学研究,并增加了另1个病例。我们的研究结果提示这些肿瘤表现出子宫内膜样和浆液性分化的谱系,显示MELF型的肌层浸润、ER表达、KRAS和TP53突变,以及侵袭性行为。
  子宫内膜样癌的危险因素包括肥胖、绝经后雌激素替代、卵巢功能障碍、糖尿病、不孕症、未产妇和服用他莫西芬药物。绝大多数子宫内膜样癌能够用无对抗的雌激素假说来解释,该假说提出,暴露于无孕激素抵抗的雌激素环境中会导致子宫内膜细胞的核分裂增加、DNA复制错误数量增加,以及导致恶性表型的体细胞突变。在我们的研究中,患者的平均年龄为58.6岁(范围为38-78岁),且3名患者均为患有病态肥胖(100-130公斤)的未生育妇女。
  组织学上,这些肿瘤具有独特的表现。非子宫内膜样成分类似于卵巢低级别浆液性癌,表现为显示分级分支的纤细乳头。衬覆的上皮细胞有轻到中度的核非典型性。此外,病例1中的腹膜和附件转移类似于浆液性交界性肿瘤相关的侵袭性种植。Soslow等报道了1例显示低级别浆液样形态的低级别子宫内膜癌并在结肠中复发。另一方面,最近描述的子宫内膜中肾癌可局灶显示低级别浆液样形态和可有侵袭性行为。然而,我们研究中的混合性癌主要位于子宫内膜,与中肾增生无关,与绒毛腺性子宫内膜样成分混合和ER阳性表达。
  所有3例在原发性子宫内膜肿瘤中均有砂粒体。有趣的是,病例1中,砂砾体也见于大网膜及淋巴结转移灶中,形态学非常类似于浆液性交界性肿瘤的侵袭性种植。虽然该病例中双侧卵巢和输卵管均有转移,但转移灶很小(<4mm),多发而浅表。文献已报道了8例伴砂粒体的子宫内膜样癌。不同于我们研究中的混合性癌,我们的病例含有砂粒体,旺炽性的微乳头成分缺失,炎症和坏死更加明显,预后良好。砂砾体也可见于约25%的浆液性癌中。
  另一个有趣的发现是所有3例中都存在MELF。Stewart灯和Castilla等发现显示MELF模式的肌层浸润的子宫内膜癌发生了上皮间质转化,与不良预后密切相关。在我们的研究中,1例肿瘤具有侵袭性行为,发生广泛的腹膜播散,另1例病人死于脑肿瘤但因病人没有活检而不能确诊为转移。然而,这种肿瘤具有不良的预后因素包括广泛的肌层浸润和TP53突变。第3例虽然无病生存,但仅存活了半年。
  KRAS突变可见于10%-30%的子宫内膜癌中,也可见于一些子宫内膜增生。有趣的是,Berg等发现KRAS活化在伴复杂性非典型增生的肥胖患者中更常见。几乎所有伴KRAS突变的子宫内膜癌为伴粘液分化的子宫内膜样癌,常与微卫星不稳定相关。我们所有的病例都有KRAS突变:病例1和2在外显子2(p.Gly12Asp;p.Gly13Asp),病例3在外显子3(p.Arg248Gln)。相反,在子宫浆液癌中KRAS突变非常罕见。Zhao等使用全外显子测序研究了57例子宫浆液性癌,发现只有3例(5%)发生KRAS突变。在一项平行研究中,利用二代测序发现10例浆液性癌中有2例发生KRAS突变(数据未显示)。
  TP53突变可见于5%-10%的子宫内膜样癌(最常为3级、偶尔2级)和90%以上的浆液性癌(2型肿瘤)中。总之,TP53突变发生于50%的3级子宫内膜样癌,而不是1级子宫内膜样癌或非典型增生。这一发现表明p53参与了子宫内膜样癌的进展而不是启动。在我们的研究中,3种混合性癌中有2例发生TP53突变。相应地,p53免疫表达在1例(病例3)为强而弥漫性,而在另1例中则完全呈阴性(病例2)。虽然在这些肿瘤的首次描述中,病例2被认为是p53野生型,但在TP53突变检测和免疫组化染色复习后,该肿瘤被解释为p53异常(完全阴性)表达。病例3也显示实性-筛状子宫内膜样3级成分;而且,在子宫内膜活检中仅见一小灶具有高级别细胞核及许多核分裂象的浆液性癌。所有这些区域均强阳性表达p53。
  总之,我们使用二代测序技术展示了3例伴“低级别浆液样”成分的混合性子宫内膜样癌的临床病理、免疫组化和分子遗传学的研究。这些肿瘤显示子宫内膜样和浆液性分化的谱系及MELF特征,并存在KRAS和TP53突变和侵袭性行为,但不符合TCGA分子组别 的任何一种。
  Espinosa I, D'Angelo, Corominas M, et al. Mixed endometrial carcinomas with a “low-grade serous”–like component: a clinicopathologic, immunohistochemical, and molecular?genetic study. Hum Pathol, 2018,71:65-73
责任编辑: 晨凫
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