南京市30家医疗单位病理组织处理方法调查分析

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  作者:魏雪,何燕,章如松,王璇,余波,陈辉,周晓军,马恒辉
  近年随着病理技术的快速发展,病理组织处理模式已由人工操作转为全自动密闭式组织脱水机的广泛使用。病理组织的固定、脱水、透明以及浸透等处理已进入恒温、恒湿的标准化和规范化操作,所有这些变化有效地提升病理组织制片的质量。本文选取南京市30家医疗单位进行调查分析,旨在调查各单位病理组织处理的现状,发现可能存在的问题,以期更好的为病理组织的处理提供良好的参考依据及改进措施,共同提高病理组织处理水平。
  1材料与方法
  1.1材料收集南京30家医疗单位参加调查(28家公立医院、2家病理检验中心),调查信息包括各单位详细的组织处理程序:如组织处理溶液、组织处理方法(时间、温度)等。分析方法以各单位为独立的观察单位,采用百分比统计分析方法进行。
  1.2制备法本组所有参加调查的单位均在全自动密闭式脱水机中进行,使用自动组织处理程序。参加调查的各单位在病理组织制片流程中的每一环节所涉及的试剂全部依据龚志锦等编著的《病理组织制片和染色技术》、王伯禨等编著的《病理学技术》、仲剑平主编的《医疗护理技术操作常规》以及中华医学会编著的《临床技术操作规范·病理学分册》等标准实施[1-4]
  1.3溶液选用(1)固定液:①10%中性福尔马林:40%甲醛10份,水90份。②中性福尔马林:甲醛液100ml,蒸馏水900ml,加入适量碳酸镁或碳酸钙作为中和剂,中和后前者约为pH7.6,后者为pH6.3~6.5。③中性缓冲福尔马林:甲醛液100ml,蒸馏水900ml,NaH2PO4.H2O 4.0g,Na2HPO6.5g;使pH值达6.8~7.0。④AF液:95%或无水乙醇(A)90ml,40%(浓)甲醛(F)10ml。此液兼有脱水作用,固定后可直接入95%乙醇继续脱水。⑤AAF液:95%或无水乙醇(A)90ml,冰醋酸(A)5ml,40%(浓)甲醛(F)10ml。此液兼有脱水作用,冰醋酸能把未分裂细胞核的染色质沉淀成为可以染色的块状体,细胞核因此被显示清楚。(2)脱水液:梯度乙醇为70%、75%、80%、85%、95%以及无水乙醇。(3)透明液:①二甲苯。②硬脂酸熔点56~69.6℃。(4)浸蜡液:石蜡熔点范围为42℃、54℃、56~58℃以及58~60℃。所选定的试剂配方要综合考虑实际使用中的标本数量、温度、湿度等多种因素,结合实际情况使用对照比较,选用最合适的配方。
  1.4处理流程(1)固定:取材后立即固定,以抑制组织自溶,保持各种组织的原状。(2)冲洗:常规固定液可用流水冲洗,水流不能急,缓慢冲洗。(3)脱水:是固定后组织处理的第一步,即从组织成分内去除游离的水分和多余的固定液。(4)透明:作为脱水和浸透溶液之间的透明溶液,它既要能溶解于脱水液,又要能溶解于浸透液。(5)浸蜡:石蜡是组织实验室最常用的渗透和包埋剂,组织需包埋于石蜡等物质中,使液态变固态,且有一定硬度,才能用切片机切成薄片。
  2结果
  2.1固定剂
  参加调查的30家医疗单位选用固定剂种类繁多,详见表1。(1)使用10%福尔马林的9家单位,6家设置甲醛液1缸,3家2缸,总时间为1~4h,只有1家过夜。(2)使用中性甲醛液的9家单位,7家设置中性甲醛液1缸,2家2缸,总时间为1~2h。(3)使用中性缓冲福尔马林的4家单位,2家设置中性缓冲福尔马林1缸,2家2缸,总时间为1~2h。(4)使用AF液的单位1家,AF液1缸,总时间为2h。(5)使用AAF液的单位2家,设置AAF液2缸,总时间为3h。(6)使用甲醛/AF液的1家单位,甲醛和AF液各1缸,总时间为2h50min。(7)使用甲醛/AAF液的1家单位,甲醛和AF液各1缸,总时间为2h。(8)使用中性甲醛/AF液的单位1家,中性甲醛液设置3缸,总时间为1h30min,AF液1缸,时间1h。(9)使用中性甲醛/AAF液的单位1家,设置中性甲醛液和AAF液各1缸,总时间为2h30min。(10)使用中性缓冲甲醛/AAF液的单位1家,设置中性缓冲甲醛液2缸,总时间为5h30min。(11)温度设置:1家38℃,1家40℃,余28家均为常温。
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  2.2脱水剂
  参加调查的30家医疗单位均使用乙醇作为脱水剂。(1)使用的梯度乙醇分别为70%、75%、80%、85%、95%以及无水乙醇。(2)各家单位乙醇脱水液起始浓度的选择详见表2。1家设置乙醇4缸,2家5缸,14家6缸,7家7缸,5家8缸,1家9缸。总时间:2家3h,2家4h,3家5h,6家6h,7家7h,3家8h,3家9h,1家10h,2家11h,1家12h,1家过夜。(3)温度设置:1家35℃,1家40℃,1家50℃,余27家均为常温。
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  2.3透明浸蜡剂
  参加调查的30家医疗单位在透明和浸蜡步骤有两种方法。(1)9家单位选择硬脂酸和石蜡混合液透明兼浸蜡和石蜡浸蜡。正常设置分别为两缸混合液,硬脂酸和石蜡的比列第一缸和第二缸分别为3∶2和2∶3。其中,4家单位硬脂酸石蜡混合液设置2缸、石蜡设置1缸,2家单位硬脂酸石蜡混合液设置2缸、石蜡设置2缸,1家单位硬脂酸石蜡混合液设置1缸、石蜡设置2缸,1家单位硬脂酸和石蜡混合液(硬脂酸和石蜡比例2缸均为2∶3)设置2缸、石蜡设置1缸,还有1家单位硬脂酸和石蜡混合液(硬脂酸和石蜡比例为3∶2)仅设置1缸。温度设置3家60℃,3家65℃,2家65~70℃,1家70~80℃。(2)21家单位选择二甲苯透明,石蜡浸蜡,其中二甲苯和石蜡的使用情况详见表3。二甲苯温度设置1家单位35℃,1家单位40℃,1家单位60℃,余18家单位常温。(3)30家单位石蜡熔点2家为42℃,1家为54℃,2家为58~60℃,余25家均为56~58℃。(4)石蜡设置和时间,6家为2缸,总时间为3~6h。3家为3缸,总时间为3h。12家为4缸,总时间为1h30min~6h。(5)石蜡温度设置详见表4。
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  3讨论
  病理组织切片质量的好坏直接影响病理诊断的准确性,没有质量过关的病理组织切片就没有准确的病理诊断。在病理组织切片制备过程中,虽然组织处理是最基本的操作之一,但却是保证组织切片质量最重要的基础。如果前期组织处理不佳,即使后期操作规范,仍然无法制备出高质量的病理组织切片。因此,做好组织处理是病理技术质量控制环节中最基本且最重要的环节。
  本次调查结果显示,目前南京市30家医疗卫生单位已全部使用组织处理机进行组织处理,虽然有效地降低组织处理各环节中人工操作带来的质量不稳定性,但依然有些单位在组织处理个别环节甚或大部分环节,存在错误或不规范的做法。为了规范组织处理的流程,有效地提高组织处理的技术水平,我们建议在病理组织处理环节着重注意以下几点。(1)固定环节:能有效地保存细胞和组织成分,减少组织的损伤,是组织处理前最重要的步骤之一[1-2]。在正式开始组织处理前必须保证组织充分固定,如果组织固定不适当、不完整,制出的切片组织结构出现自溶现象,此时做HE染色,组织结构模糊,细胞核质不分明。组织中抗原物质丢失严重。固定液的质量非常重要,至少每周更换一次,使组织标本能够彻底固定。固定液陈旧、改变其PH值呈中性或弱碱性的性质,发生酸化对组织中酶的活性有影响[3]。4%甲醛液存放一段时间后极易氧化产生甲醛,呈酸性,不宜固定标本,而采用中性福尔马林具有良好的固定作用,穿透速度快,组织硬化程度小[4],其细胞形态保存良好,层次分明,基本无萎缩。(2)脱水环节:乙醇脱水能力强,在脱水过程中继续硬化组织,是一种优良脱水剂。但高浓度乙醇对组织有强烈收缩、硬化作用,因此在脱水过程中一般从低浓度开始,逐步递进其浓度。有文献报道[5]将此类组织块用二甲苯多次脱蜡后,入梯度乙醇直至水化,再重新脱水有一定效果。故宜及时固定组织,更换试剂,掌握好脱水时间,延长组织在95%乙醇中的脱水时间,做到彻底脱水。含蜡组织块脱水不足是指处理病理标本时组织块脱水不尽而被浸蜡甚至包埋,以致石蜡不能完全浸透组织,失去应有的支持作用,表现为含蜡组织块发软,制成蜡块后组织块与周边石蜡容易发生脱离,此种蜡块往往难以切出组织薄片,即使强行切出也会出现组织挤压、破碎,影响病理诊断。在组织脱水环节,所有单位均采用乙醇作为脱水剂,乙醇与水呈完全互溶性质,乙醇较为经济,适合优选为常规组织脱水剂[6]。组织脱水时间在低浓度乙醇中可以长些,尽量避免在高浓度的乙醇如无水乙醇中停留的时间过长,否则会造成组织过硬、扭曲,影响切片[5,7],影响病理医师阅片。(3)透明环节:9家(30%)单位选择硬脂酸和石蜡混合液透明,21家(70%)单位选择二甲苯透明石蜡浸蜡透明。调查中发现选用硬脂酸和石蜡混合液作为透明浸蜡剂,硬脂酸的含量不易控制,特别对于含脂肪较多的组织,使用硬脂酸取代二甲苯易发生脱片[8],不能保证制片质量的稳定性。处理的组织倘若硬脂酸置换不彻底,在展片中会出现组织在水中离散及免疫组化染色掉片的问题。经二甲苯处理的组织容易发脆、发硬,特别是子宫肌瘤、子宫颈、甲状腺的血凝块、淋巴结等组织,切片易出现“搓衣板样”或“百叶窗样”,经硬脂酸石蜡混合液处理则不存在该现象。组织未及时固定引起组织腐败、干燥;组织块过厚或所取组织太多;脱水液浓度不能达标或容量过少;用于透明的二甲苯内混有少量杂质(如酒精、水等);用于浸蜡的液状石蜡内混有大量杂质等以上情况均会造成组织块浸蜡不彻底。及时检查所收标本的状况,包括固定液的种类、浓度及量;及时更换脱水所用的酒精、透明用的二甲苯及用于浸蜡的液体石蜡;必要时重新取材或重新浸蜡及时补救。(4)浸蜡环节:选择石蜡需要质纯,无气泡和杂质,有适度的黏韧性。石蜡分为软蜡(熔点50~54℃)和硬蜡(熔点56~60℃)。软蜡多用于组织浸透,硬蜡多用于组织包埋。夏季室温高时可选用熔点较高的硬蜡,在冬季室温低时可选用熔点较低的软蜡。一般情况下,太硬切片时容易破碎,不易切成蜡带;反之,如采用的石蜡太软时,切片常皱缩,难以成蜡带,贴片时也难把切片摊平。组织浸蜡时,最好采用熔点为54℃的软蜡。一般组织浸蜡时间为2~4h。
  本次调查针对组织处理的附加方法如搅拌、加压和试剂质控等数据,因文章篇幅有限未及涵盖。
  (本文获得南京市30家医疗单位病理技术同行的大力支持和帮助,特此致谢!)
  参考文献:
  [1]龚志锦,詹镕洲,著.病理组织制片和染色技术[M].上海:科学技术出版社,1994:16-20.
  [2]仲剑平.医疗护理技术操作常规[M].北京:人民卫生出版社,2003:1985-1988.
  [3]王伯禨,李玉松,黄高异,等.病理学技术[M].北京:人民卫生出版社,2000:67-82,129.
  [4]中华医学会,编著.临床技术操作规范·病理学分册[M].北京:人民军医出版社,2004:1-26.
  [5]马恒辉,周晓军.组织切片常见问题与对策[J].临床与实验病理学杂志,2009,25(2):211-214.
  [6]马恒辉,周晓军.组织固定处理及包埋常见问题与对策[J].临床与实验病理学杂志,2011,27(6):638-641.
  [7]赵宝忠,张立华,李恩鸿.病理组织脱水剂及组织脱水工艺的再认识[J].临床与实验病理学杂志,2011,27(4):438.
  [8]周茜.环保醇性组织固定液和硬脂酸石蜡混合液制片的探讨[J].诊断病理学杂志,2012,19(2):157.
责任编辑: 晨凫
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