全自动免疫组化染色仪进行CD20和CD3双染技术的心得体会

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  在常规苏木素和伊红(HE)染色切片以及常规免疫组化标记的基础上诊断淋巴瘤有时比较困难,尤其是遇到肿瘤中存在较多的T淋巴细胞和B淋巴细胞时,诊断更为困难。应用CD20和CD3免疫组化双染技术,可以在一张淋巴组织切片中同时观察到B淋巴细胞和T淋巴细胞,再根据这些细胞的分布和构型,有利于对肿瘤组织学结构的判读,从而更加容易的作出明确的诊断。免疫组化双染技术操作步骤多,每一个环节都会影响标记结果。本实验应用全自动免疫组化染色仪进行CD20和CD3免疫组化双染技术,操作简单,染色结果理想,染色后切片保存方便,是一种值得推荐的方法。
  1.材料与方法
  1.1材料来源:收集2008年至2010年复旦大学附属中山医院病理科存档标本27例,其中弥漫性大B细胞淋巴瘤10例、间变性T细胞淋巴瘤2例、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤8例、外周非特异性T细胞恶性淋巴瘤7例。
  1.2主要试剂:CD20(购自Dako,克隆号L26), CD3(购自Leica,克隆号LN10),Leica BOND专用HRP-DAB检测系统(编号DS9800),Leica BOND专用RP-FAST RED检测系统(编号DS9390)。
  1.3仪器设备 Leica BOND-MAX全自动免疫组化染色仪,附件有Dell电脑及免疫组化操作流程软件、标签打印机、稳压器。
  1.4染色方法:(1)常规石蜡切片60℃烤片2小时;(2)选择Leica BOND-MAX全自动免疫组化染色仪附带电脑内的顺次双染程序,第一个抗体CD20采用IHC-F染色程序,第二个抗体CD3采用IHC-J染色程序,用标签打印机打印出标签。将标签贴在已烤片切片的左侧,再次将切片放入染色仪的染色架上,将两种一抗和两种二抗试剂盒加入染色仪后,仪器开始运行,直至程序结束取出切片;(3)切片梯度酒精脱水至二甲苯,中性树胶封片。
  2.结果
  根据染色方法,淋巴组织中表达CD20的B淋巴细胞呈棕色;表达CD3的T淋巴细胞为红色。应用全自动免疫组化染色仪进行CD20和CD3免疫组化双染技术,可以在同一张切片上清楚地分辨出淋巴瘤中的B淋巴细胞和T淋巴细胞。
全自动免疫组化染色仪进行CD20和CD3双染技术的心得体会
全自动免疫组化染色仪进行CD20和CD3双染技术的心得体会
弥漫性大B细胞淋巴瘤(a为免疫组化双染照片,表达CD20的B淋巴细胞呈棕色,表达CD3的T淋巴细胞为红色;b为常规HE染色。)
全自动免疫组化染色仪进行CD20和CD3双染技术的心得体会
全自动免疫组化染色仪进行CD20和CD3双染技术的心得体会
外周非特异性T细胞恶性淋巴瘤(a为免疫组化双染照片,表达CD20的B淋巴细胞呈棕色,表达CD3的T淋巴细胞为红色;b为常规HE染色。)
  3.讨论
  淋巴瘤的种类复杂,单纯HE切片诊断非常困难,虽然免疫组化标记对诊断淋巴瘤有所帮助,但是遇到肿瘤中存在较多的T淋巴细胞和B淋巴细胞时,如某些弥漫性大B细胞淋巴瘤或间变性T细胞淋巴瘤,诊断仍然较为困难。此时应用CD20和CD3免疫组化双染技术,可以在一张淋巴组织切片中同时观察到两种特异性抗原的表达状况,有助于区分哪些是B淋巴细胞,哪些是T淋巴细胞,再根据这些细胞的分布和构型,可更好地帮助区分哪些是肿瘤性细胞,哪些是反应性细胞,有利于对肿瘤组织学结构的判读,从而更加容易的作出明确的诊断。
  全自动免疫组化染色仪进行CD20和CD3免疫组化双染技术是采用两种一抗和两种酶顺次双染的方法,在一张淋巴组织切片上明确地标记出B淋巴细胞和T淋巴细胞。免疫组化双染技术的关键是标记的两种抗原之间没有交叉染色,两种显色要对比鲜明,所以要选取特异性较高的抗体来标记并选择合适的显色系统。本实验应用CD20来标记B淋巴细胞,选择过氧化物酶(HRP)标记的显色系统,选择显色剂DAB;应用CD3来标记T淋巴细胞,选择碱性磷酸酶(AP)标记的显色系统,选择显色剂FAST RED,染色后的B淋巴细胞呈棕色,T淋巴细胞呈红色,对比明显,利于观察和诊断。
  免疫组化双染技术操作步骤多,每一个环节都会影响标记结果。手工操作时抗体加入不到位、组织稍有干燥或冲洗不干净,就会造成背景深、边缘反应重,两种标记对比不明显,影响诊断。与手工操作相比,全自动免疫组化染色仪进行CD20和CD3免疫组化双染技术,标记结果顺利,背景清晰,定位良好,无边缘效应,两种标记对比明显。
  以往免疫组化双染后的切片一般要采用水溶性封片剂,如长时间放置,切片中常出现水溶性封片剂干涸、气泡增多或酶显色反应颜色弥散现象,所以切片要尽快拍照存档。本实验中采用的两种显色系统所用的显色剂均为非醇溶性的,染色后切片可以梯度酒精脱水至二甲苯用中性树胶封片,避免了以往水溶性封片剂封片后染色结果保持时间不长的缺陷。
  本实验应用全自动免疫组化染色仪进行CD20和CD3免疫组化双染技术,在一张淋巴组织切片中同时检测T和B淋巴细胞及其起源的肿瘤,操作简单,染色结果理想,染色后切片保存方便,是一种值得推荐的方法。
  参考文献:
  [1]周韩波,王琳等;高温高压处理在消除双重免疫组化染色交叉反应中的应用[J]。临床与实验病理学杂志,2008;24(2):232-3。
  [2]陈罡,罗殿中,韦康来等;双重免疫组化染色法的操作体会 [J]。实用医技杂志,2004;(06):721-722。
  [3]肖同浩,彭正银,陈寿松等;双重免疫组化染色在区别毛细淋巴管和毛细血管中的应用。华南国防医学杂志,2006;(4):39-40。
责任编辑: 晨凫
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