常规病理学技术流程及质控

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  作者:郑州大学第三附属医院 河南省妇幼保健院 病理科副主任技师 党秋红

  病理学技术(pathological techniques)是病理学的一个重要分支,是病理学研究中的方法学,是病理诊断的基础。常规病理是病理技术最重要的部分,任何病理诊断离不开它。
  病理技术包括:1 常规病理 2 特殊染色 3 细胞学制片 4 免疫组化 5 分子病理学技术 6 电镜技术 7 冰冻切片技术等
  常规病理技术是研究形态学必不可缺少的重要方法之一,是现代病理新技术的基础。
  优点:简单易操作,基本满足日常工作需要(常规技术,常规染色)。
  常规病理技术流程包括:
  1)固定 2)取材 3)再次固定 4)脱水(包括脱水、透明、浸蜡) 5)包埋 6)切片 7)染色 8)封片
  一、取材
  此步骤在技术员协助下由病理医师完成。取材的好坏,直接影响切片的质量。
  医生在取材时,首先要有一把锋利的取材刀,在切割组织时要避免取材刀来回拖拉。
  取材组织块厚薄要均匀,一般厚度以0.2~0.3cm为适,体积不超过2x1.5x0.3cm。小组织或液体沉淀物:先用拭纸或滤纸妥为包裹,然后放入专用小盒内进行4%中性缓冲甲醛固定,切忌避免检材遗失。
  较易发脆的组织(如甲状腺、肝脏、血块、淋巴结、大块癌组织等)可适当厚一些,而脂肪、纤维性肿瘤、平滑肌肿瘤等致密的或试剂不易渗入的组织应取薄一些;淋巴需切开淋巴结包膜,并尽量剔除周围的脂肪组织。在取材中还应十分注意组织内是否有缝线或骨组织,如碰到不可避免的钙化组织,应与技术室讲明,骨组织应先脱钙再取材。在切取纤维组织、肌肉组织、胃肠道时,应注意纤维及肌肉的走向,取材时尽可能按与纤维平行走向切取为佳。
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  取材的注意事项:
  1、每例标本取材前,取材医生和技术人员共同核对该标本的例数、内容、病变特征及其标志是否与申请单一致。
  2、准确无误将病理标本号用打号机或手工书写在脱水盒上方,登记的病理标本号必须与脱水盒上的号码必须一致,如实清楚地将病理医生的口头描述记录与电脑。
  3、取材完毕后,取材医生和技术人员共同核对取材组织块及其编号准确无误后置入脱水盒内,并在记录单和取材工作单上签名并签署日期。
  4、核对无误后放入脱水机进行脱水。
  5、脱水机试剂定期更换,保证脱水液的浓度。
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这是我们科莱卡SP300的脱水程序
  二、组织固定
  准确的病理检测是诊断和制药两大领域的桥梁和关键依据,组织规范化固定是量化检测的基础和保证。
  Bencroft将组织固定剂分为:醛类、氧化剂类、蛋白变性类等。目前推荐使用10%中性缓冲福尔马林(PH7.2-7.4),NBF能够很好的保存细胞形态、蛋白、核酸,穿透力强,4h渗透深度3.7mm,8h渗透4.7mm,应用最广。
  固定是技术工作的第一步,组织固定不当或不良对标本造成的影响是无法纠正的弥补的,也是在整个制片过程中无法弥补的一步。固定是良好组织切片的的基础,特别是对后续诊断、免疫/分子检测及研究工作造成的不良影响是无法挽回的。
  固定是通过添加剂让组织中所有细胞及细胞外成分迅速死亡,以避免细胞中溶酶体成分的破坏作用,保持离体组织细胞与生活时相似,并防止细菌繁殖所致的腐烂,保存蛋白质与核酸的基本结构。
  固定的目的:
  1、保持离体组织与生活时的形态相似,抑制组织自溶及细菌繁殖所致的腐烂。
  2、使细胞内的特殊物质定位,保持其原有结构。如细胞内的蛋白质、酶等经固定后可沉淀或凝固。
  3、保持细胞内组织抗原、DNA及RNA,便于进一步特殊检查,如特殊染色,免疫组织化学染色,细胞遗传学,分子病理以及科研等。
  4、使组织硬化,便于切片。
  5、可增强染色的作用。便于光镜下对细胞内的不同成分进行区分。细胞内的不同成分沉淀凝固后折光率及对染料的亲和力有所不同,染色后可加以区分。
  6、有利于诊断的准确及相关科研的开展。
  固定的方法:
  1、及时固定 2、及时剖开 3、特殊固定 4、微波固定
  组织固定的注意事项:
  1、适宜固定液的量 应为组织的5-10倍,一般情况下固定液为组织的10倍以上为好,大标本不少于总体积的8倍。
  2、适宜的时间 组织固定越新鲜越好。组织一经离体,就能及时地固定,这是最好的。根据实验,如果要获得某些酶的染色,固定最好在组织离体后30秒至1分钟。对于其它达不到要求是越快越好,30分钟之内。大多数组织应在固定24h内进行取材。
  3、适宜的取材 一般厚度原则上不超过5mm(2-3mm最为合适)的情况下固定时间为3-24h。
  4、适宜的温度和搅拌 大多数组织在室温(25度)固定,在低温如4度固定时间相应延长。全自动组织脱水机可以施加恒定的温度、适宜的搅拌和试剂循环功能使得组织在有限的时间内完成固定过程,一般情况下将固定的时间温度控制在35度左右。
  5、适宜的容器 固定的容器相对要大。
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固定不足、脱水不足
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  固定不当的补救措施:
  1、组织过厚,固定液不足造成组织中心未固定,先将组织切薄后逐级退回到80%乙醇,水洗后再用10%NBF重新固定3h再进行常规脱水处理即可。
  2、组织已经干涸的标本:组织干涸的标本可采用AF液作为固定剂,AF固定剂中的乙醇能使结缔组织膨胀再进行脱水透明浸蜡,整个过程时间要缩短。
  3、未固定好就直接脱水的组织:多发生于小组织,可在切片脱蜡至水后,用AFA固定液浸泡5-10min,再进行染色会达到一定效果。
  三、脱水
  脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来,以利于有机溶剂的渗入,这一过程称为脱水。常用的脱水剂是乙醇。
  脱水原则:1.将组织内水分脱干净但又不使组织硬化;2.乙醇脱水应由低浓度至高浓度进行。
  低浓度酒精在组织中穿透力很强,比高浓度更易渗透到组织内部。组织蜡块脱水不尽,与空气接触后会出现凹陷。
  四、透明
  为了使石蜡浸入到组织块内,必须经过一种既能与脱水剂混合,又能与石蜡相溶的媒介物质,这个过程称透明。常用的透明剂是二甲苯。二甲苯是乙醇和石蜡最好的媒介剂。
  一般组织30分钟(3mm厚度组织),较大组织一般控制在2小时以内。
  组织块透明不彻底,呈白色浑浊状态,需再放入脱水剂中,待彻底脱水才能透明。
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固定、脱水问题:细胞核不上色
  五、浸蜡
  组织透明后,在熔化的石蜡内浸渍的过程称为浸蜡。浸蜡温度控制在58~62℃左右,略高于石蜡的熔点。
  六、包埋
  是用包埋剂来支持组织的过程,最常用的是石蜡包埋法,包埋的关键一是平整,二是方位。要求在包埋时,应采用镊子轻压组织块拱起部份,使之平贴于底部,通常采用 组织的最大面包埋。囊壁、管腔组织应竖直包埋。小块多颗组织,应尽量放在一起,并保证在一个平面上。包埋时还应注意有无缝线,纸絮,如有一定要去除。
  包埋的注意事项
  ①应将组织块严格分件包埋。包埋时一定要首先认真核对组织块的病理号(包括亚号)、块数和取材医师对包埋面的要求,发生包埋差错时,必须立即与取材医师和病理科当班负责人取得联系,及时处置。
  ②必须严防各种异物污染,勿将无关组织(包括缝线、纸屑或其他异物(尤其是硬质异物)埋入蜡块内。
  ③包埋过程要操作迅速,以免组织块尚未埋妥前熔蜡凝固。
  ④包埋用的熔蜡应纯净,熔点适宜。浸蜡Ⅰ用软蜡(熔点为45-50℃),浸蜡Ⅱ、Ⅲ和包埋用蜡均用硬蜡(熔点为56-58℃)。
  ⑤包埋用熔蜡使用前应将先静置沉淀、过滤。
  ⑥熔蜡时不得使用明火,以防燃烧。包埋用熔蜡的温度应<65℃;包埋用的镊子不可加温过高,以免烫伤组织。
  ⑦组织包埋时按压平整。聚集包埋。
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  七、切片、烤片
  用切片机将包埋有组织的蜡块切成薄片。切片厚度一般为4-6微米,切片的要求是完整、薄、均匀。病理切片技术的精确度直接影响诊断的准确性。
  展片水温应在42℃至47℃之间,确保组织上的皱摺充分展开。
  皱褶展开的要点:第一、可以在切片时边切边向蜡片吹气,这样的片子就会非常平整,放到热水里就会自然展开,比较方便快捷,但这样的片子会略微厚一点;第二、在切完片子后,先把切片放在30%酒精水溶液中,让酒精的张力自动把皱摺展开,然后再将切片移到热水,这样的片子会较薄(脂肪类组织一碰到酒精就会散开,故不能用此法)。第三、最后捞片时玻片要干净,要选择那些完整、无皱摺的切片,粘贴于玻片中1/3和下1/3的中间。
  烤片和脱蜡  一般在65℃的温箱内烤片25分钟左右。温度过高,会引起切片细胞收缩;时间太短(少于20分钟),容易造成脱片。脱蜡也相当重要,如果脱蜡不干净,切片不易着色或着色不匀,所以,脱蜡用的二甲苯要经常更换,一般用3道二甲苯,每500ml液体,处理500张切片后更换一次为宜。当室温低于18℃时,必须将切片从温箱拿出后立即放入二甲笨。
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粗切不当导致的“空洞”假象
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  八、染色
  常规染色或HE(Haematoxylin and eosin)染色。它是病理技术中最常用的一种染色方法,通过它可以做出病理诊断和发现寻求别的辅助方法,以达到准确,完整的病理诊断。
  (1)、染色目的:病理学的所有切片,都必须通过一种以上的染料,通过各种不同的方法,将切片中各种不同的物质,在不同染液的作用下,将其显示出来,使之在光学显微镜下,能够完全的观看各种结构。例如,HE染色,好质量的切片可以清晰地显示出许多不同的结构,细胞核着蓝黑色,细胞浆着粉红色,软骨着蓝色等。清晰的结构为诊断提供可靠的依据,因此,染色技术也是病理技术中的重要组成部分,必须不断地总结,方能提高。如果染色不好,切片染色一团糟,红蓝不分,结构不清,层次不明,影响了镜下的观察,直接影响了病理诊断,染色结果的好坏直接关系到诊断的准确性。  
  (2)、染色方法及步骤
  1.人工苏木素,伊红染色法(HE法)
  (1)切片浸入二甲苯中5-10min。
  (2)切片浸入二甲苯中5-10min。
  (3)100%酒精1min。
  (4)100%酒精1min。
  (5)95%酒精1min。
  (6)95%酒精1min。
  (7)90%酒精1min。
  (8)80%酒精1min。
  (9)自来水洗1min。
  (10)浸入苏木素染液浸染10-15min。
  (11)自来水洗30second-1min。
  (12)1%盐酸酒精分化2-5second。
  (13)流水冲洗10-15min,或返蓝液30s-1min,水洗5分钟。
  (14)1%伊红3-5min。
  (15)自来水洗。
  (16)80%酒精1-2s。
  (17)95%酒精2-3min。
  (18)95%酒精2-3min。
  (19)无水酒精3-5min。
  (20)无水酒精3-5min。
  (21)二甲苯3-5min。
  (22)二甲苯3-5min。
  (23)中性树胶封固。
  九、封片
  切片染色完成后,从低浓度的酒精到高浓度的酒精脱水。浓度低的酒精比浓度高的酒精更容易脱水,但也容易使伊红退色,故脱水时间可短一点,切片经二甲苯透明后,用中性树胶封固。
  为增加切片的透明度,防止细胞收缩、龟裂或切片出现黑色结晶样小点。所以切片必须湿封。随着自动封片机的应用,完美解决了封片溢胶问题。
  粘贴标签,标签必须贴于玻片左侧,编号打印清晰。
  十、染色结果
  细胞核呈蓝色,细胞质、肌纤维、胶原纤维、和红细胞呈不同程度的红色。
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组织脱蜡时间以二甲苯使用时间和室温而定
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苏木精残渣易吸附在含有黏液的组织,黏附上无法去除,须过滤苏木精染液后重新切片、染色
  十一、组织切片制备的质量控制评分标准
  1.组织制片过程中,应确保切片号与蜡块号一致。
  2.制片工作一般应在取材后2个工作日内完成(不含脱钙、脱脂等特殊自理的标本)。
  3.制片完成后,技术人员应检查制片质量,并加帖标有本病理科病理号的标签。常规石蜡包埋—HE染色片的优良率(甲、乙级切片所占的比例)≥90%,优级率(甲级切片所占的比例)≥35%。不合格切片应立即重做。
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病理常规石蜡包埋HE染色切片质量标准及评分表
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  注:切片质量分级标准:
  甲级片:≥90分(优);乙级片:75~89分(良);
  丙级片:60~74分(基本合格);丁级片:≤59分(不合格)
责任编辑: tanlin
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