原位多聚酶链式反应应技术

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  原位多聚酶链式反应技术是多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术的一部分,后者是在体外经酶促反应将某一特定DNA序列进行高效、快速扩增,它可将单一拷贝的待测核酸以指数的形式扩增而达到常规方法可检测的水平,但不能进行组织学定位。原位PCR(in situ PCR)技术是将PCR的高效扩增与原位杂交的细胞及组织学定位相结合,在冷冻或石蜡包埋组织切片,细胞涂片或培养细胞爬片上来检测和定位核酸的技术。
  原位PCR技术方法
  原位PCR技术有直接法原位PCR,间接法原位PCR,原位反转录PCR(in situ reverse transcription-PCR,RT-PCR)和原位再生式序列复制反应(self-sustained sequence replication reaction,3SR)等方法,其中应用相对较广泛的是间接原位PCR方法。其主要程序有组织固定,预处理(如蛋白酶K和RNA酶消化),原位扩增及扩增产物的原位杂交和检测等。由于使用原位杂交技术对扩增产物作检测,使该方法的特异性较直接法高。
  原位PCR技术的应用及存在的问题
  原位PCR技术能用于低拷贝的内源性基因的检测和定位,在完整的细胞样本上能检测出单一拷贝的DNA序列,可用于基因突变,基因重排和染色体易位等的研究和观察。还可用于外源性基因的检测和定位,如对各种感染性疾病病原的基因检测,如EB病毒、人乳头状瘤病毒、肝炎病毒、巨细胞病毒和人免疫缺陷病毒基因组及结核、麻风杆菌基因的检测等,在临床上还可用于对接受了基因治疗患者体内导入基因的检测等。
  从理论上讲,原位PCR是一个较完美的技术,兼有较高的敏感性和基因的细胞内定位功能,但目前该技术方法还欠完善,主要表现在以下几个方面:①特异性不高,特别是假阳性的问题。可能产生假阳性的原因有引物扩增序列的弥散等。提高其检测结果的特异性,必须设计严格的实验对照,包括已知阳性和阴性对照,引物对照,PCR反应体系对照和用DNA酶和RNA酶处理后样本的阴性对照等;②技术操作复杂,影响因素太多;③需要特殊的设备,即原位PCR仪,多为进口,价格昂贵,加之技术方法上存在的问题等,短时间内还难于在国内大面积推广使用,但有一定的潜在应用前景。
 
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责任编辑: 左尹
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