周晓军:如何提高组织处理的技术水平

免疫组化抗体神器

好评必备! 免费下载

  作者:马恒辉,周晓军
  组织标本离体后,要经过固定、脱水、透明、浸透和包埋等一系列的后续处理,以保证病理诊断的需要[1-3]。组织处理的每一个步骤都非常重要,因为标本的取材,部位的选择等等,都或多或少地会影响到组织处理的程序、染色的效果以及最终的诊断是否合适。组织结构的保存、有效成分的保留,取决于组织处理所使用的试剂和各步骤处理的时间等因素。为病理诊断提供优质的切片需要技术人员在日常的工作中不断积累熟练的技巧和经验。为了提高组织处理的技术水平,本文就组织处理的相关理论和具体实践,进行交流讨论。
  一、组织处理的相关理论
  1、组织的固定
  固定能有效地保存细胞和组织成分,减少组织的损伤,是组织处理前最重要的步骤之一[4,5]。固定使蛋白质成分保持稳定,使溶酶体的活性减弱,防止细胞及其内成分自溶。在正式开始组织处理之前必须保证组织充分固定,如果组织固定不适当,不完全,可能会改变组织的染色特性。如果处理前组织固定不完全,则必须在机器处理的液槽中增加补充固定的处理。
  使用特殊固定液固定的组织,在处理前需要进行相应的处理。含苦味酸固定的会形成水溶性的苦味酸盐,故处理前需要将组织放置在70%乙醇里进行处理。含乙醇的固定液,如Carnoy液体,在处理前可将组织直接放进95%乙醇。
  为帮助微小破碎组织,在包埋操作时易于识别操作,组织处理前可浸泡在1%伊红液中5~10min。伊红的粉红色在组织处理时可以保留,但是在随后的切片染色中可以洗去不影响正常的染色。
  2、组织的处理
  组织处理的步骤分为脱水、透明、浸透和包埋,目的是去除多余的水分,代之以起支撑作用的包埋剂的浸透,保证组织足够的硬度,切片时不至于使组织扭曲或损害。
  ① 影响组织处理的因素
  组织标本在包埋盒中的大小、厚薄决定了组织处理所需的时间。通常将组织块切取成(1~115)cm×(1~115)cm×013cm大小[6],厚度不能超过包埋盒的厚度,以免阻碍组织与液体的交换。如果条件允许,将大小标本分开处理。当组织浸泡在液体中时,液体与组织及组织周围的相互交换就产生了。液体交换的效率取决于组织暴露并接触液体的面积。影响组织与液体交换的因素有搅拌、加温、黏度、真空等[1-3]。搅拌有助于促进新鲜液体在周围组织的流动。自动组织处理机可以通过由垂直、旋转的振荡或施加压力的方式,定时交换液体达到机械搅拌的目的。有效的搅拌可以缩短组织标本处理时间的30%。加温可以增加液体交换与穿透的效率,但是,必须注意尽量少用,防止出现组织扭曲、变硬、变脆。温度最好控制不高于45℃比较有效,高温对随后的免疫组织化学有影响。黏度是阻碍液体流量的参数。溶液里液体分子的颗粒越小,液体渗透速率就越快(低黏度);相反,如果液体分子的颗粒越大,液体交换速率就越低(高黏度)。大多数用于组织处理的溶液、脱水剂和透明剂都具有相似的黏度,但松柏油除外。包埋剂具有多重黏度。石蜡融化后呈低黏度,能增强对组织的渗透速度。利用减压能增加渗透率,缩短组织标本在每一步的处理时间。利用真空能从组织中去除试剂,主要适用于易于挥发的液体。真空能有助于去除多孔组织内的空气,致密的组织、脂肪多的组织,在处理过程中通过真空辅助,能够有效地减少液体渗透的时间。真空设置用在自动组织处理机不能超过15IN/Hg,以免破坏组织。
  ② 组织的脱水
  脱水是固定后组织处理的第一步,即从组织成分内去除游离的水分和多余的固定液。许多脱水剂是亲水的,在与组织中水分子交换时,具有强烈的极性。其他的脱水剂是通过不断地稀释组织内多余水分的方式来达到脱水的目的的[2,3]。脱水处理过程应缓慢进行。否则,造成细胞内外液体浓度的不平衡,当液体交换时,就会通过细胞膜发生细胞内成分扩散流动到细胞外的现象,增加细胞破坏的可能性。为此,脱水过程常须经过一系列梯度溶液来完成。过度脱水易导致组织变硬、变脆甚至扭曲。当然,脱水不足将阻碍透明剂渗透到组织内部,使得组织因水分过多导致标本发软,或无法透明。
  脱水剂的种类有很多种,如乙醇、丙酮、甲醇、异丙基醇等。如果用乙醇进行脱水处理,起始浓度最好为70%乙醇水溶液,随后是95%乙醇和100%无水乙醇。对特别易破碎的组织标本,推荐起始浓度为30%乙醇。变性醇使用方法同乙醇,甲醇可替代乙醇,异丙醇不易产生组织硬化和扭曲,经常用于微波处理程序。丁醇最初用于植物和动物组织学,是一种缓慢型脱水剂,极少产生组织扭曲和硬化现象。丙酮是透明无色易燃液体,易与水、乙醇和大多数有机溶液相混合。其脱水快,但渗透差,脱水时间长易引起组织扭曲和变形。丙酮用于脱水可以去除组织中的脂肪。苯酚(石炭酸)可以作为添加剂放入脱水溶液中,对筋、腱、指甲等致密组织和角化蛋白等起到软化的作用。使用的方法是,将苯酚溶入95%乙醇溶液,配成4%的浓度。另外,坚硬的组织也可以
  置入甘油乙醇混合液中浸泡处理。
  ③ 组织的透明
  作为脱水和浸透溶液之间的透明溶液,它既要能溶解于脱水液,又要能溶解于浸透液。大多数透明溶液是碳氢化合物,对组织中的蛋白具有折射能力。当脱水溶液被用于透明的溶液完全置换后,组织呈半透明状态。因此,这些溶液被称之为“透明液”。透明剂的沸点象征融化的石蜡替代透明剂的速度,低熔点的溶液一般来说较快被置换,黏度也同样影响渗透速度。缺点是组织长时间置于透明溶液易导致组织变脆,透明时应密切注意。在确保致密组织块能够足够透明的同时,小的易脆的组织也不至于透明过度而损坏。
  二甲苯作为透明剂适用于各种大小不同的组织处理,组织处理时过度透明易造成组织变硬。甲苯与二甲苯有相同的属性,组织长时间透明也不易损伤。氯仿的透明速度比二甲苯慢,易引起组织变脆,合适的组织厚度是1mm左右。常用于神经系统的组织处理,组织块在氯仿中不会呈“半透明”状态[4]。甲基苯甲酸脂和甲基水杨酸酯,这两种是缓和型透明溶液,可用于双重包埋时。柠檬油试剂是从柑橘类植物如柠檬皮壳中榨取获得,无毒,易溶于水。使用后废弃时可直接经实验室水处理中心处理,节能减排,符合环境保护的理念,缺点是有刺激性的气味。另外,该溶液可能会使组织中铜或钙等矿物质沉淀产生溶解。
  ④ 组织的浸透
  石蜡是组织实验室最常用的渗透和包埋剂。它是一种从石油分解中产生的长链状碳氢化合物,具有宽泛的熔点,对各地不同的气候条件均可适应。它的物理属性根据不同的熔点而定:低熔点石蜡通常较柔软,高熔点石蜡通常比较坚硬,耐受切片。加热石蜡达到一定的温度,可以改变石蜡的熔点。石蜡熔点通常在40~70℃之间。包埋时组织经石蜡浇灌,形成模型可防止切片对组织结构的损伤。为了切片时提供优良的蜡带,应选择合适熔点的石蜡。含有增塑剂和树脂的石蜡市场有售,提供广泛的选择,方便实验室的需要。这些物质虽然能够帮助石蜡达到良好的硬度以利于包埋切片,但是,以往添加到石蜡中的物质包括:蜂蜡、橡胶、塑料聚合物等,而这些添加剂的熔点均高于石蜡,故使用时可能会使组织变脆。
  ⑤ 组织的包埋
  包埋的媒介物质必须充满组织标本,保持细胞的成分,提供弹性,防止切片损坏,以利于切片。许多实验室使用包埋中心,该中心由3个部分组成:自动流蜡器、冷台以及储备模型和组织包埋盒的热槽。石蜡经过喷嘴自动流入大小合适的包埋模。组织在包埋模型中排列方向和位置,加盖塑料包埋盒,形成一个带有组织的平行的蜡块。模型先放在一小块冷冻区域让石蜡凝固。快速冷固石蜡会导致残留的水分形成“冰晶”结构,切片时产生人为的改变。当组织包埋时,组织的方向对证明或显示组织的形态是一个重要的问题[2]。组织的定向或定位不应该对组织切片有影响。错误的定向可能会导致所需组织成分的破坏或错误的诊断。有些辅助措施可以确保组织正确的定向:涂抹染料,使用活检组织小袋、海绵和软纸等。大部分组织是平埋的,组织周边的包埋介质将对组织起到保护作用。以下组织需要特殊定向包埋:腔性结构如动脉、静脉、脉管需横切;皮肤、肠道、胆囊、膀胱和其它上皮类活检组织,应从底下开始切片,保证组织的上皮面最后切到,这样可以减少对上皮的挤压,损伤切片;肌肉活检:横向和长纵向切片;多块碎组织应一个接一个排列,保证组织结构在包埋时排列方向上的一致。
  二、组织处理的具体实践
  根据我们多年的工作实践,在此列举一些具体的组织处理程序,供大家交流讨论。对不同的实验室不同的工作情况,大家可以对工作表中的内容,如不同的液槽、完成处理需要的总时间以及前固定的时间等,进行调整修改,以满足各自实验室不同的工作需要。
  1、组织标本的过夜处理(表1)
组织标本的过夜处理
  对许多实验室来说,过夜处理是相对常用的一种处理模式。组织固定浸泡于10%缓冲或非缓冲的福尔马林或AF液,各级浓度的乙醇、二甲苯或二甲苯的替代物,以及石蜡浸透。使用自动组织处理机制定程序时应考虑影响处理程序的以下诸多因素:即实验室所需要的结束时间;使用的液体是否需要加热;是否启用真空功能;组织标本数量的多少及体积的大小等[1,2]。该处理程序的特点是,组织标本固定时间比较充分,在低浓度乙醇停留时间较短,在高浓度乙醇和二甲苯时间不能过长。组织标本在石蜡时间较短,各槽时间不均等,前面时间比后面时间略短。所有步骤均启用气压/真空功能。除石蜡为60℃,其余均为38℃。
  2、眼球组织的处理(表2)
  脑、眼、骨等特殊组织需要专门的处理。以眼球的处理为例,因为眼球具有某些特殊的结构如坚硬的部分,所以需要特殊处理[1]。事先必须将眼球切开充分固定随后处理,苯酚(石炭酸)可以掺到乙醇中降低浓度起到软化巩膜和晶状体的作用。选择适当的液体提供最好的脱水和透明。氯仿可用作透明剂,因为它比二甲苯刺激性小,较少引起组织的收缩,使视网膜在处理时不被脱落。眼球标本可以用大号的塑料包埋盒和包埋模。该处理程序的特点是,眼球组织标本在上机处理前已剖开充分固定,从低浓度乙醇开始脱水,其中在70%乙醇中添加苯酚,起软化作用。在脱水后透明前使用乙醇氯仿混合液进行过渡处理,避免组织直接进入乙醇会引起组织的收缩。各步骤时间均相对较长,以保证眼球组织标本处理质量。
  3、活检小组织标本的处理(表3)
活检小组织标本的处理
  近年来,内窥镜切除标本和细针穿刺活检小组织标本,利用加温(37~45℃)和真空功能可以在2~5h之内完成处理任务。厚度通常在2mm左右,大多数小组织标本能够适应于短时间处理程序。如果组织固定不是很充分,处理过程应该设置一个10%福尔马林的溶液槽。表3显示了一个为内窥镜小组织标本设置的缩短时间的处理步骤。内窥镜标本在处理过程中,每步消耗的时间均为10min左右。程序可以修改,不同步骤的时间可以根据预定结束的时间而相应改变。如果使用密闭式组织处理模式,每一批次的标本处理结束,必须用二甲苯、无水乙醇和水等液体清理洗涤仪器中剩余的石蜡。
  该处理程序的特点是,活检小组织标本从低浓度到高浓度依次处理。首先强调固定的重要性,另外,每一步骤时间、气压/真空及温度设置均可一致。
  4、小组织标本手工处理
  现在虽然手工组织处理方式很少使用,但是在某种特殊状态下,仍然有需要手工组织处理方式,如机器维护保养或电源故障;大的组织标本需要长时间处理,而不便在自动组织处理机上处理时;小的组织标本如移植肠黏膜活检标本,因观察有无排斥反应,需要在短时间内做出诊断等。将小组织标本置入塑料包埋盒,盖好盖子后浸入10%福尔马林,水浴10min。将塑料包埋盒从福尔马林固定液取出后移入95%乙醇10min,可以用磁力搅拌器操作。继续进入100%无水乙醇10min和二甲苯溶液10min,操作同上。融化的石蜡浸透10min,常规石蜡包埋。
  该处理程序的特点是,步骤简单,时间简短。需要加以辅助的手段,如使用磁力搅拌、超声波、微波等,才能保证在短时间内完成小组织标本的手工处理效果。
  5、其他组织的特殊处理
  某些特殊的因素,石蜡不能满足正常切片的需要,如:组织处理液体破坏和溶解组织成分和需要诊断的对象;组织要求必须适当的保存,加热功能会影响组织中部分酶、抗原的作用;浸透的媒介硬度不够难以在切片时支撑组织。此时需要在石蜡中增加一定的包埋介质。树脂一般专用于进行超薄切片的组织和不脱钙组织的包埋。琼脂凝胶并不能单独提供足够的硬度用于组织切片,其主要用途在于在组织固定后它所具有的黏着力,尤其是小的破碎的组织。组织碎块包埋在融化的琼脂中,凝固后能满足常规组织处理及切片粗修等。用细小的滤网将固定液中的组织碎片进行过滤,小心地将融化的琼脂凝胶灌注离心管中,等琼脂凝胶硬化后,常规组织处理、石蜡包埋。明胶主要用于辅助器官的切片和冷冻切片。火棉胶或低粒度硝化纤维素用处减少,是因为仅仅用于神经病理学标本,因浸泡处理耗时,所以现在很少使用。
  用于组织处理的机器或设备发生故障时,导致组织在浸蜡之前发生干燥(干涸),组织可能会失去正常的形态,以下纠正处理的方法有助于帮助组织得到可以满足诊断需要的切片。组织干燥的修复方法:70%乙醇70ml,甘油30ml,二硫水杨酸钠1g,组织在该溶液停留数小时或过夜。组织处理重新从脱水液开始直至完成。组织切片时可能有些困难,为防止组织脱片可使用涂胶载玻片。
  三、组织处理的现状与发展
  组织处理的基本方式,是利用一个可控制的环境,在合适的时段内,对组织块进行一系列液体的交换处理。很长时间以来,这一处理模式相对来说没有发生大的变化,只是近年来因引用特别的处理方法如微波等加快的方式,使得处理时间有所缩短。
  第一代用于组织实验室的组织处理机,是一种开放式的组织交换处理方式和自动控制的液体交换系统[5]。这一类型组织处理机的工作方式,是组织放在一定的模具内,经过一系列液体,处理一定的时间,组织标本在盛放液体的容器里浸放的时间由电子元件控制。早期控制组织处理完成时间的模式是在钟面上刻个印痕,垂直振荡或机械上下运动使组织标本浸放的容器提供组织处理所必须的搅拌作用。
  近年来,密闭式自带真空组织处理机成为大多数实验室的主要设备[1-3]。组织装入处理槽后,一直到处理结束都停放在槽内。各类处理用的液体和融化的石蜡,在真空和气压的作用下,按顺序进入处理槽进行作用,每一步骤均可使用附加功能达到促进组织处理的作用,如时间、温度、真空和(或)气压。该系统的优点在于,许多步骤可以使用附加的真空和加热功能,按用户具体要求定制的时间表,液体溢出容器,气味消除装置。这类组织处理机还带有自动报警和故障发生时错误信息识别系统。
  带有独特的微波处理技术的组织处理机目前也很普遍。微波可以将组织处理时间从小时缩短到分钟。微波辐射通过增加组织内部的受热,可以加强液体对组织的渗透,缩短组织经手工操作从一个容器传递到另一个容器作用的时间。许多实验室的微波炉带有精确的时间控制器、温度控制器和溢液收集系统。组织处理时间根据组织标本的厚度和密度而定。通常可用于微波快速处理的液体包括乙醇、异丙醇或含有乙醇和异丙醇的混合物以及石蜡等。液体的分级浓度无须考虑。透明液体无须使用,因为最后浸蜡的温度足以使组织内的乙醇、异丙醇或含有乙醇和异丙醇的混合物从组织中蒸发。另外,福尔马林和二甲苯也不用于这一处理模式,因为它们可能会散发有毒的气味和致癌的物质。这一系统的优点:合适控制的处理,提供完善的形态学结构和组织标本的抗原活性,增加效果,通过改良交换时间,使用利于环境保护的液体,更大的好处在于减少使用的液体数量和体积。缺点是工作人员使用时,因手工操作而繁琐。另外,由于缺乏实验室级使用的医用微波炉,合适的使用温度需要用温度计测量和监控。
  随着技术的改进,即利用微波技术,真空浸透,选择对形态学结构保护良好的液体,提升了封闭式组织处理机的功能。组织标本只须经过4个液槽,即丙酮、异丙醇、聚乙烯乙二醇、石蜡油和石蜡,即可实现连续的输入和快速的处理模式。微波和搅拌作用用于促进液体在组织间的扩散。采用新型微波技术,替代高水平的微波功率,使其在标本处理操作时持续处在低功率状态。这一系统的优点在于可以允许组织连续间隔的进入,促进循环的时间。使用安全环保型的液体,减少有毒气体在实验室的排放。组织标本的形态和质量与传统的相比较一致。缺点是该类组织处理机花费昂贵,对组织样本的厚度要求较高,需要经过标准化的取材切割,获得一致厚度的组织标本,才能保证处理效果。
 
  参考文献:
  [1]BancroftJD.Theoryandpracticeofhistologicaltechniques[M].London:Churchilllivingstone,2008:83-92.
  [2]CarsonFL,HladikC.Histotechnology:aself2instructionaltext[M].Chicago:AmericanSocietyofClinicalPathologistsPress,2009:31-52.
  [3]ProphetEB.Armedforcesinstituteofpathology.Laboratorymeth2odsinhistotechnology[M].WashingtonDC:AmericanRegistryofPathology,1992:29-31.
  [4]王伯,李玉松,黄高等。病理学技术[M]。北京:人民卫生出版社,2000:76-82。
  [5]仲剑平。医疗护理技术操作常规[M]。北京:人民卫生出版社,2003:1985-8。
  [6]中华医学会。临床技术操作规范·病理学分册[M]。北京:人民军医出版社,2004:3-9。
  ·国外期刊文摘·
  胃的微乳头状癌:TNMⅠ~Ⅱ期中具有更差预后的特殊亚型EomDW,KangGH,HanSH,etal.Gastricmicropapillarycarcinoma:AdistinctsubtypewithasignificantlyworseprognosisinTNMstagesⅠandⅡ.AmJSurgPathol,2011,35(1):84-91.
  微乳头状癌(MPC)是腺癌的一种侵袭性变型,尽管在多个器官具有较高淋巴结转移率,但发生在胃的微乳头状癌尚无详细描述。为此,作者对比研究了胃的MPC和不伴有MPC成分的胃腺癌(非MPC)的临床病理特征,包括患者的存活数据和细胞黏附分子(E2cad、β2catenin、IQGAP21和CD44v6)免疫组化的档案资料。作者对比了72例MPC和160例不伴有MPC的胃腺癌病例。多数胃的MPC来自管状或乳头状腺癌,MPC成分所占比例在5%~80%之间,MPC更易出现淋巴管浸润和淋巴结转移(P<010001),TNM分期更高(P=01019),老年更多(>65岁;P<010001),并且更易出现CD44v6和β2catenin的异常表达(P<010001)。MPC患者的5年生存率比不含有MPC成分的患者更差(30%vs67%;P=01002)。此外,同等TNM分期情况下,Ⅰ~Ⅱ期内MPC患者和不含MPC的患者生存率显着不同(P=010003),但在Ⅲ~Ⅳ期之间却无差别。通过单变量分析(P=010003)和多变量分析(P=0.04)Ⅰ~Ⅱ期胃的MPC患者预后更差。结论:胃癌中识别MPC成分非常重要,因为MPC成分常伴有更广泛的淋巴结转移,尤其是Ⅰ~Ⅱ期胃癌患者,预后更差。
  (解建军摘译,张仁亚审校/山东省聊城市第二人民医院病理科,临清 252601;济宁医学院附属医院病理科,济宁 272029)
  【本文系原创文章,转载请注明转载网站名称“91360智慧病理网”及网址出处;本站所有文章仅供公益交流学习,不代表本站立场。欢迎提供素材、资料等,投稿邮箱:tougao@91360.com,一经采纳将给予稿费。】
责任编辑: 巫哲