免疫组化捞片法的具体实验步骤

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  实验时,把切片放于装有PBS的EP管中,或类似于48孔细胞培养板的圆底板中;把针灸针头磨平,并弯成直角,用此捞片方便,对片子损伤少。
  一、免疫组化捞片法的具体步骤
  切片在EP管中或培养板中进行
  1、冰冻切片后0.01MPBS漂洗3次,每次5分钟;
  2、3%过氧化氢(用PBS配)20分钟,室温;
  3、0.01MPBS漂洗3次,每次5分钟;
  4、一抗37度2-4小时,然后4度过夜;
  5、0.01MPBS漂洗3次,每次5分钟;
  6、二抗1:200,37度2-4小时;
  7、0.01MPBS漂洗3次,每次5分钟;
  8、三抗1:200,37度1-2小时;
  9、0.01MPBS漂洗3次,每次5分钟;
  10、DAB显色5-10分钟,蒸馏水终止反应;
  11、贴片;
  12、脱水;
  13、封片。
  二、甲醛固定后的石蜡切片的捞片的步骤
  1、将切好的蜡带用齿科镊夹持一端,蜡带的另一端接触水面,然后顺势向一个方向移动;
  2、使蜡带平铺在水面上,待切片展平,用处理过的载波片捞片,手持载波片一端,将载玻片另一端放进靠近组织的水中,选择贴片的位置,慢慢将玻片提起,使蜡带的一段贴到玻片上,然后提起载玻片,注意载玻片应该和水面垂直,将组织贴到玻片上;
  3、最后将玻片放到展片仪上展片烘干。
  三、甲醛固定后石蜡切片的捞片注意事项
  1、各种抗体孵育时可以在EP管中,或类似于48孔细胞培养板的圆底板中,但PBS漂洗时最好选用大些的培养皿等,这样易于漂洗干净。捞片用的工具可以用粗一些的毛细管在酒精灯上拉出一圆钝形小钩即可。
  2、基本实验步骤与免疫组化捞片法相同,但一抗浓度及孵育时间需要一定时间摸索,稀了呈阴性,浓了背景太深;二抗三抗如果自己配制的话,也需要摸索浓度时间等,还要注意抗体间的匹配;另外,二抗三抗如有工作液试剂盒,就直接滴加,毋庸稀释。
  3、DAB配好后一般半小时失效,要尽快用。反应要在光镜下检查控制。显色刚好时中止反应。一般说明书上要求用蒸馏水中止,但我们实验发现,蒸馏水中止后,片子很粘,不易贴片。我们改用0.01M PBS中止反应效果很好。不妨一试。
  4、捞片后,不要急着立即脱水封片,这时容易掉片,待其晾干后再脱水。
 
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责任编辑: 朱征青
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